抗原特异性调节性T细胞的培养扩增

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1、分类号：R657．3密级：学位类别：科学学位团专业学位口学校代码：1062学号；2010602651学科门类：医学又滓眚科鼻辱硕士学位论文MASTER’SDISSERTATIoN论文题目：抗原特异性调节性T细胞的培养扩增TITLETheCultivationandAmplificationofAntigen-specificRegulatoryTCells一级学科：临床医学二级学科：外科学普外论文作者：王永磊指导教师：朱志军教授天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明I㈣L———————————————————一本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作

2、取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：_乏垒趁日期：砂}k多厅√扫学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密团。(请在相对应的方框内打“√”

3、)学位论文作者签名导师签名天津医科大学硕士学位论文中文摘要【目的】培养扩增出抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞，并观察其免疫抑制功能，为今后临床利用抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞诱导器官移植免疫耐受提供新思路。I：；b-法】本实验分两部分：第一部分，提取小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞：利用免疫磁珠分选系统分选Balb／c小鼠脾脏的CD4+CD25+Treg细胞，包括阴性分选获得CD4+T细胞，阳性分选获得CD4+CD25+Treg细胞。并用流式细胞仪检测分选后细胞的纯度及Foxp3表达率。第二部分，培养扩增抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞：①提取C57小

4、鼠脾细胞，经丝裂霉素C灭活后与提取的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg细胞(10：1)于96孔培养板中混合培养，培养基选用RPMll640完全培养基，配以10％胎牛血清、rmlL一22000U／mL、雷帕霉素100nmol／mL，37。C、5％C02、100％湿度培养箱中培养14天，第3、5、7、9、ll天换液，第14天收集细胞；②T细胞增殖抑制实验，检测培养后CD4+CD25+Treg的抗原特异性。实验分成四组：第一组(实验组)：C57小鼠CD4+CD25一T细胞+培养后的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾细胞；第二组(对照组)：C57小鼠CD4+CD2

5、5。T细胞十未培养的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾细胞；第三组(空白对照组)：C57小鼠CD4+CD25。T细胞+C57小鼠脾细胞；第四组(第三方对照组)：昆明小鼠CD4+CD25’T细胞+培养后的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾细胞。通过观察比较各组CD4+CD25+T细胞增殖情况的不同判断扩增出来的CD4+CD25+Treg是否有抗原特异性。⑧不同浓度CD4+CD25+Treg对T细胞的增殖抑制试验：将培养后的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg与C57小鼠CD4+CD25。T细胞分别按0．5：l、1：1、2．1、4：1、8：

6、1混合培养，观察各孔中CD4+CD25"F细胞的增殖情况。④数据用统计软件SPSSl4．0软件进行统计学处理。正态分布的变量，两组之问比较采用独立样本f检验；非正态分布变量比较采用秩和检验。检验水准0【=0．05。【结果】第一部分：利用免疫磁珠分选系统，经阴性分选及阳性分选，可分选出纯度达90％的CD4+CD25+Treg细胞，Foxp3表达率达95％以上，其分离方法稳定、高效，可用于进行相关研究。天津医科大学硕士学位论文第二部分：’1．C57小鼠特异性CD4+CD25+Treg细胞的培养扩增：Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg细胞加入C57小鼠脾细胞(1：10)，经过14天培

7、养后，Balb／e小鼠CD4+CD25+Treg细胞约扩增10倍。2．T细胞增殖抑制试验：各组培养72小时后，流式细胞检测结果显示：①实验组中C57小鼠原代CD4+CD25。T细胞比例明显比对照组中的高(86．0％±3．9％VS．40．6％±1．9％，P<0．05)，因此利用C57小鼠脾细胞扩增出的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg细胞比新鲜提取的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg细胞对C57小鼠CD4+CD25‘T细胞抑制作用