大量扩增抗原特异性活化t细胞的方法研究

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2、TcellsDr．QijunQianProfessorCoHegeofLifeSciences，ZhejiangSci-TechUniversityMar．2014HANGZHOU．CHINA万方数据浙江理工大学硕士学位论文大量扩增特异性活化T细胞的方法研究分类号；UDC：论文答辩日期2014．3．10密级：答辩委员会席金洁论文评阅人金华君鄢和新苏长青答辩委员会员钱文斌金华君解纯刚张世馥万方数据浙江理工大学硕士学位论文大量扩增特异性活化T细胞的方法研究浙江理工大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是

3、本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：串气影签字日期：为哗年，月f_日万方数据浙江理工大学硕士学位论文大量扩增特异性活化T细胞的方法研，学位论文版权使用授权书Y2700IIIIIlllIIIIIIIIIH314llllllOIIIll本学位论文作者完全了解

4、渐江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权烫塑基垦达堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：躺觳签字日期：j!刀『年年弓月f2，Et导师签名：戤分签字日期：矽脚年弓月f易曰万方数据浙江理工大学硕士学位论文大量扩增特异性活化T细胞的方法研究中文摘要癌症的高发率和年轻化的趋势已经越来越威胁到人类的健康。目前，已有的治疗方法包括

5、：外科手术切除法，放疗，化疗等等。但是目前这些方法都不能完全治愈癌症，然而，过继性免疫细胞治疗为癌症的治疗带来了新的希望。与传统的肿瘤治疗方法不同，大多数免疫治疗在消除肿瘤的过程中显示出重要的作用，而且可以通过诱导免疫记忆来建立肿瘤与机体之间新的平衡，从根本上治愈肿瘤。免疫细胞治疗技术与其他抗肿瘤策略如手术、放化疗的联合应用已经证实优于单一的治疗方案，极大拓宽了细胞免疫治疗。过继性免疫细胞治疗是指通过输入自身或同种异体的肿瘤杀伤细胞来治疗肿瘤的方法。它不仅可以纠正细胞免疫功能的低下，促进宿主抗肿瘤免疫的功能

6、，还可以直接发挥抗肿瘤的作用。其中细胞毒性T细胞的过继治疗有着特殊的优越性。细胞毒性T细胞的过继治疗是实体肿瘤，尤其是肿瘤相关抗原比较明确的恶性黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、前列腺癌、肺癌等的研究热点。特异性CTLs(细胞毒性T细胞)的产生是通过将肿瘤抗原负载成熟的DC(树突状细胞)刺激T细胞从而获得单一抗原的特异性CTLs克隆。这种CTL能识别并杀伤携带相应肿瘤抗原的恶性细胞，经过大量的扩增就能应用于临床治疗。这种治疗方法相比其他的治疗方法具有易获得、可操作性强，靶向性好，安全性高等特点。但是，过继性T细胞转

7、移还面临很多的问题：DC的成熟程度低，免疫耐受，特异性活化T细胞的数量不足等等。由于DC扩增具有很大的难度，所以这也间接限制了特异性活化T细胞的数量。本文主要通过以下三个步骤建立扩增抗原特异性T细胞的方法：(1)用Ficoll密度梯度离心的方法从癌症病人外周血中分离单核细胞后贴壁培养并将悬浮的T淋巴细胞冻存以备后续试验之用。培养单核细胞时加入细胞因子FLT3L，GM—CSF，IL一4诱导分化，在培养第6天以MOI值为5加入Ad5一MUP53负载抗原。最后加入细胞因子TNF—a，LPS，PGE一2诱导DC成熟

8、。(2)将培养成熟的DC与相同人的初始T细胞以1：10的比例共培养。在之后的万方数据浙江理工大学硕士学位论文大量扩增特异性活化T细胞的方法研究培养中连续加入DC刺激T细胞形成抗原特异性的活化T细胞。培养细胞过程中每两天加入IL-2，IL-7，IL一15促进细胞的生长。(3)将共培养后的T细胞转入包被了CD3，C1)28抗体的小培养瓶中培养，并进行大量扩增。培养细胞过程中每两天加入IL一2，IL一7，IL一15促进