血小板-t细胞活化抗原1

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1、血小板/T细胞活化抗原1　　有趣的是，PTA1的基因序列与1996年DNAX分子与细胞生物学研究院Shibuya等发表的DNAM-1分子（DNAXaccessorymolecular-1,DNAM-1）序列相同。DNAM-1分子的发现过程同PTA1十分相似，最初制备针对人CTL的单抗，发现其中DX11单抗能明显抑制CTL对多种肿瘤细胞系(如Colo205、PA-1、MCF7等)的杀伤作用。Shibuya等首先从外周血单个核细胞(PBMC)中通过DX11单抗亲和层析纯化了DX11识别的抗原，进行了部分蛋白序列测定，以多肽对应的PCR引物扩增出DNAM-1的部分片段

2、，再以32P标记的探针进行筛选，最终获得了DNAM-1的cDNA序列。Shibuya认为DNAM-1分子是一种新的粘附分子，并可能与信号转导有关〔6〕。　　到目前为止，PTA1的配体（PTA1ligand,PTA1L）尚未基因克隆成功。本实验室已成功构建、表达了PTA1胞膜外区/IgG1Fc段融合蛋白，通过PTA1/Ig融合蛋白进行的免疫组化及粘附阻断实验证实PTA1配体表达于肿瘤细胞系Colo205细胞膜表面。PTA1配体的鉴定正在进行之中。　　PTA1的基因及结构　　1997年Sherrington等从以pCDM8为载体的活化Jurkat细胞cDNA文库中，

3、通过Leo-A1单抗panning的方法筛选得到人PTA1阳性克隆〔5〕。人PTA1基因为单拷贝基因，定位于染色体18q22-q23。其cDNA全长1.4kb，5和3端分别有174bp和111bp非编码区。开放读框1　011bp，编码336个氨基酸，包括18个疏水氨基酸的信号肽，成熟蛋白由318个氨基酸组成，属I型跨膜糖蛋白。胞膜外区由232个氨基酸组成，形成2个免疫球蛋白超家族V样结构域，这种结构在免疫球蛋白超家族成员中是唯一的一个。PTA1分子第19和90位的保守半胱氨酸形成链内二硫键，第134和204位的保守半胱氨酸形成第二个链内二硫键，这2个二硫键分

4、别起到稳定胞膜外区2个结构域的作用。在90位和204位半胱氨酸处均存在免疫球蛋白超家族V样结构域的特征性基序Asp-X（Gly或Ala）-X-Try-X-Cys基序。PTA1胞膜外区含有8个潜在的N-糖基化位点和3个潜在的O-糖基化位点。当用内切糖苷酶（EndoF）消化N-连接的糖基后，PTA1的相对分子质量减小了30×103，表明PTA1分子胞膜外区是高度糖基化的，这可能与PTA1参与分子识别有关。PTA1的糖基中含有大量的唾液酸，神经氨酸酶（neuraminidase）消化唾液酸后，其pI由3.5～4.2转变为7.8～8.2。PTA1穿膜区由25个疏水氨基酸

5、组成。胞浆区有61个氨基酸，含有3个酪氨酸、6个丝氨酸和6个苏氨酸，胞浆区尾部含有一段EDIYVNY基序，中央酪氨酸的氨基端有2个带负电荷的谷氨酸和天冬氨酸（ED），羧基端为缬氨酸、天冬酰胺和酪氨酸（VNY），此基序可作为非受体型蛋白酪氨酸激酶（proteintyrosinekinase,PTK）的底物。并可以和蛋白酪氨酸磷酸酶2（proteintyrosinephosphatase2,PTP2）氨基端的SH2结构域结合。另外，在PTA1胞浆区还存在着酪蛋白激酶Ⅱ（caseinkinaseⅡ）和PKC作用的底物S/T结构。胞浆区的上述结构和基序提示PTA1分子可

6、能参与T细胞和血小板活化的信号转导过程〔4，5〕。人、猿、猴PTA1分子cDNA及蛋白水平的同源性为93%～95%，表明PTA1在生物进化过程中高度保守并可能具有重要的功能。　　Burns等通过Leo-A1单抗亲和层析的方法从血小板上纯化了PTA1分子，并进行了蛋白部分序列测定，证实PTA1分子为一全新的分子。通过纯化的PTA1分子再次免疫制备了抗PTA1的单克隆抗体NEA刺激的Jurkat细胞膜表面，并且平均荧光强度相同，但NEA刺激的Jurkat细胞膜表面着色，当增加Jurkat细胞膜通透性后，NEA刺激的Jurkat细胞及血小板胞膜，再用磷酸肌醇磷脂酶C（

7、phosphatidylinositolphospholipaseC）处理细胞，然后在Jurkat细胞上清中可以检测到从细胞膜上释放的PTA1抗原，表明PTA1分子至少是部分通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol,GPI）方式锚定于细胞膜上的。其它参与细胞信号转导的膜表面分子中，有部分是通过GPI方式锚定于细胞膜表面的。而在血小板上清中未发现PTA1抗原的释放，可能血小板PTA1分子主要以跨膜方式连接于血小板胞膜上，另一种可能是血小板胞膜对外源性酶的作用不敏感。　　PTA1的表达及表达调节　　已获得的实验证据表明，PTA1主

8、要表达于巨核/血小板谱系