T细胞体外扩增培养.doc

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1、人T细胞分离与体外培养实验方案一．实验目的从人外周血中分离PBMCs，利用CD3和CD3/CD28免疫磁珠分离并扩增T细胞，用于慢病毒载体的感染。二．实验过程1．人外周血单个核细胞的分离（每mL外周血大约可获得1×106个单个核细胞）⑴采血，稀释（外周血：稀释液=1：1）；⑵在离心管中加入人淋巴细胞分离液，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）；⑶20℃，440g，离心20-30min；⑷离心后轻轻吸取中间白膜层，移入另一试管中；⑸加入足量的稀释液充分洗涤，400g，离心5min，弃上清；⑹细胞沉淀加1640培养液重悬，即可用于T

2、细胞的磁珠分选。2．CD3+T细胞分选⑴适量的MACS缓冲液洗涤PBMCs（107/mL），300g，离心10min，去上清；⑵MACS缓冲液重悬PBMCs（80μL/107PBMCs），加入CD3免疫磁珠（20μL/107PBMCs），混匀，4℃孵育15min；⑶MACS缓冲液（1-2mL/107cells）洗涤细胞1次，300g，离心10min，弃去上清；⑷500μLMACS缓冲液重悬细胞；⑸将MS分离柱放置于磁力架上，加入500μLMACSbuffer预清洗分离柱；⑹将⑷步得到的细胞悬液加入预先洗涤过的MS分离柱，先流出的细胞为未标记的CD3-T细胞

3、。MACS缓冲液洗涤分离柱3次；⑺将分离柱从磁力架上取下，放入合适的管子内，加入1mLMACS缓冲液至分离柱内，洗脱液即为CD3+T细胞，细胞计数后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬。3．CD3+T细胞的激活和扩增⑴CD3/CD28免疫磁珠预先洗涤①涡旋30s以上重悬CD3/CD28免疫磁珠；②取需要量的CD3/CD28免疫磁珠加至一个新的管中；③加入与磁珠体积相等的缓冲液（至少1mL），混匀（涡旋5min或者颠倒混匀5min）；④将管子置于磁力架上1min，弃去上清液；⑤将管子从磁力架上取下，加入与第②步取出的磁珠体积相等的培养液重悬CD3

4、/CD28免疫磁珠。⑵CD3+T细胞激活和扩大培养①将CD3+T细胞调整密度至1×106/mL于24孔细胞培养板中培养；②加入25μL预先洗涤并用培养液重悬的CD3/CD28免疫磁珠，使得磁珠和细胞的比例为1：1；③37℃，5%CO2培养箱中培养3天。④继续培养7-10天，培养基为含10%胎牛血清的RPMI1640，内加rIL-2（工作浓度30IU/mL），每2-3天更换1次培养液，细胞数达到（2-2.5）×106/mL或者培养液发黄时进行传代，细胞密度控制为（0.5-1）×106/mL。⑤如果用于流式分析，在染色前需将磁珠去除，将管子置于磁力架上1-2m

5、in，将含有细胞的上层液体转移至新的管子以分离磁珠。2．CD3+T细胞的鉴定⑴细胞活性鉴定：4g/L台盼蓝与细胞悬液（1：9）染色3min后，置于显微镜下观察细胞存活率。细胞存活率=染色阴性细胞数/细胞总数×100%。计算200个细胞中活细胞的百分比，⑵流式细胞术检测：FITC标记的抗人CD3抗体和PE标记的抗人CD8抗体，按1：1抗体/105细胞的比例，4℃避光孵育染色30min，预冷的PBS洗涤后，重悬细胞待流式细胞术检测。同型对照抗体为小鼠IgG-FITC，小鼠IgG-PE。