无血清培养基与完全培养基体外诱导扩增 cik细胞

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1、无血清培养基与完全培养基体外诱导扩增CIK细胞【摘要】目的比较无血清培养基（AIMV）与完全培养基（CM）体外诱导扩增CIK细胞及CIK细胞分泌细胞因子水平。方法分别用AIMV及完全培养基加入4种细胞因子(IFNγ、IL2、IL1及OKT3)将脐带血单个核细胞(CBMNCs)诱导成CIK细胞，比较细胞的增殖能力、细胞表型及分泌细胞因子水平。结果与完全培养基比较，无血清培养基培养的CIK细胞增殖高峰较晚(14～17天),但增殖倍数高，在细胞表型、分泌细胞因子水平方面两种培养基培养的CIK细胞均无明显的差别（P＞0.05）。结论无血清培养基可代替完全培养基。【关键词】无血清培养

2、基免疫细胞培养细胞因子肿瘤0引言CIK细胞（Cytokineinducedkiller，CIK）是将人外周血单个核细胞，在体外用多种细胞因子（如IFNγ、IL2、IL1及OKT3等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。具有极强的增殖能力及杀伤肿瘤细胞的能力。Critzapis等[1]报道，CIK细胞分泌多种细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用从而杀伤肿瘤细胞。治疗所需的CIK细胞在体外培养时所用的条件对细胞的活性有很大影响。现在常用于细胞培养的完全培养基,因含有人AB血清,虽经HBV、HCV及HIV的检测,但仍有可能传播其他疾病,安全性低;并且存在批次差异、不宜质

3、控，质量不能保证。无血清培养基则可达到生物洁净要求,成分明确,质量稳定,便于质控,克服了人ＡＢ血清的缺点,能减少病人意外感染的机会，对于免疫治疗的推广应用有重要意义。为此,我们比较了无血清培养基（ＡＩＭＶ）与完全培养基(含10%胎牛血清RPMI1640)培养CIK细胞分泌细胞因子水平。1材料与方法1.1材料健康足月产胎儿脐带静脉血50ml(枸橼酸钠抗凝),产妇各项生化指标检测正常。RPMI1640培养基、淋巴细胞分离液和无血清培养基购自GIBCO公司,细胞因子购自Bioscience公司,流式试剂CD45FITC/CD4PE/CD8ECD/CD3PC5、CD3FITCC

4、D16+CD56PE和PI染液购自BeckmanColuter公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司。1.2方法1.2.1细胞培养脐血用淋巴细胞分离液作密度梯度2500r/min离心30min分离的外周血单个核细胞,分别用完全培养基(RPMI1640,含10%胎牛血清,100μｇ/ｍｌ链霉素,100Ｕ/ｍｌ青霉素)和无血清培养基调整细胞数为1×106个/ml,接种于24孔培养板,930μl/孔。第1天加入rhIFNγ1000u/ml,培养24h后加入rhIL2300u/ml、rhIL1100u/ml及OKT350ng/ml继续培养,每隔4d更换培养基,调细胞数为1×1

5、06个/ml,补加rhIL2300u/ml,每8d在补加rhIL2的同时补加OKT350ng/ml。YTMLC、GLC和A549用含10%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640常规培养。设不加细胞因子的CBMNCs培养作为对照。1.2.2细胞表型分析于培养的第0、4、8、10、12、14、17、21d对以上各组效应细胞进行分析,每组每次测4个复孔。1.2.3细胞增殖能力测定于培养的第0、4、8、10、12、14、17、21d分别取细胞用台盼蓝拒染法计数所培养的活细胞浓度,根据流式检测的CIK的比例，计量液量,推算CIK细胞总数。1.2.4C

6、IK细胞分泌IL2、IFNγ、TNFα细胞因子水平测定于培养的第0、4、8、10、12、14、17、21d分别取细胞,充分洗涤,调整细胞浓度为2×106/ml培养24ｈ后,收集上清,用ＥＬＩＳＡ法定量测定细胞培养上清中IL2、IFNγ、TNFα，设4个平行孔。2结果2.1ＡＩＭＶ与完全培养基培养CIK细胞增殖能力的比较实验表明,ＡＩＭＶ培养细胞较完全培养基培养细胞增殖迟缓。完全培养基增殖高峰期在第12d，增殖平台为第10～12d，最高增殖倍数为638.4倍；而ＡＩＭＶ培养基增殖高峰期在第14d，增殖平台为第14～17d，最高增殖倍数为678.7倍。虽然ＡＩＭＶ培养细胞

7、较完全培养基培养细胞增殖迟缓，但其增殖平台期较长，增殖倍数较完全培养基高，见图1。图1AIMV与完全培养基培养CIK细胞增殖能力2.2ＡＩＭＶ与完全培养基培养细胞表型比较实验结果表明，两种培养基培养的细胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+细胞所占百分比逐渐增多，CD3+CD56+细胞在ＡＩＭＶ培养基中，增长高峰在14～17d，所占相对百分率由（0.21±0.04）上升为（31.53±1.65）,增长了150.14倍，完全培养基增长高峰在12～14d，所占相对百分率由（0.21