12 免疫细胞无血清培养基

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1、BioWiseTechCo.,LTD.AdvCell®免疫细胞无血清培养基AdvCell®免疫细胞无血清培养基（BICBM0001）的核心是采用无血清替代物为细胞提供一个营养全面和平衡的环境。产品适用于人及哺乳类动物免疫细胞的培养,包括T、DC﹑CIK、NK等细胞的研究及应用。通过添加不同的细胞刺激因子，可高效快速扩增相应的免疫细胞。★产品号CatNo:BICSFM0001★产品组成名称产品号规格储藏条件运输AdvCell®免疫细胞基本培养基AdvCell®ImmuneCellBaseMediumBICBM0001500ml2-8℃避光冰袋/常温AdvCell®免

2、疫细胞添加物AAdvCell®ImmuneCellCultureSupplementABICS0001A20ml-20℃避光干冰AdvCell®免疫细胞添加物BAdvCell®ImmuneCellCultureSupplementBBICS0001B1ml-20℃避光干冰★产品适用范围适用于人及哺乳类来源的免疫细胞包括T、DC、CIK、NK细胞的培养。★培养条件37℃，5％CO2无菌恒温培养。★操作步骤以下过程作为常规免疫细胞培养的一般准则，如需在生物反应器或培养袋中高密度培养，应优化条件来确定最佳的操作步骤，BICSFM0001中各组分（BICBM0001、BI

3、CS0001A、BICS0001B）在使用前37℃解冻之后混合。www.biotowntek.com4BioWiseTechCo.,LTD.【T细胞培养】1.准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC），或根据标准的外周血单个核细胞解冻程序，在37℃的水浴，快速解冻（〈1分钟）冻存的外周血单个核细胞。2.用生理盐水洗涤细胞，根据需要也可加入2-5％热灭活的人自体血浆。3.用电子（即Coulter计数器，VI-细胞）或手动的方法（即血球计数仪）给细胞计数。4.离心细胞，清除洗涤缓冲液。5.加入用AdvCell®免疫细胞基本培养基（BICBM0001）培养，培养初期，用含细

4、胞因子（如IL-2）的培养基重悬PBMC，CD3+T细胞密度保持在大约0.5-1×106/ml，转移细胞到相应的细胞培养容器（培养袋、培养瓶）。随后可应用各种操作激活T细胞，包括添加刺激的抗体或抗原呈递细胞。无论培养T细胞的规模大小，细胞均可被隔离，激活和扩大。6.在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中培养细胞，给予并维持细胞在对数期生长所需要的营养。为了保持细胞在对数期的增长，当细胞密度超过1×106/ml时，需要分离传代，维持细胞密度在0.5-1×106/ml（例如，2×106个细胞/ml以上，按1：4比例0.5×106细胞/ml）。在静态平板培养中为了获得最佳的

5、气体交换，建议培养基深度不超过1到1.2cm。【单核细胞树突状细胞﹙DC﹚培养】1.准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。2.将外周血单个核细胞铺在培养瓶中，加入适量AdvCell®免疫细胞基本培养基（BICBM0001）。3.在37℃，5%CO2的恒温培养箱中孵育2-3小时。4.弃掉含非贴壁细胞的培养基。5.用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14+单核细胞）三次。6.添加重组人IL-4和重组人GM-CSF到AdvCell®免疫细胞基本培养基（BICBM0001），至终浓度分别为50～100ng/ml和50ng/ml，并以此培养基培养贴壁细胞。保持细胞度在1～3

6、×105细胞/cm2之间。研究者可视情况加入灭活的人自体血浆。7.在37℃，5%CO2的潮湿培养箱中连续孵育5天，建议培养3天左右已添加了IL-4和GM-CSF的AdvCell®免疫细胞基本培养基（BICBM0001）换液，换液过程保留贴壁和不贴壁的所有细胞。8.培养6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a、CD80、CD86、HLA-DR）。9.向AdvCell®免疫细胞基本培养基（BICBM0001）中添加1ng/ml的LPS或者50ng/ml的TNF-α诱导的树突状细胞的成熟。www.biotowntek.com4BioWiseTe

7、chCo.,LTD.【CIK细胞培养】1.将采集的外周血收集到2支离心管中，2000rpm/min离心5min，弃上清，将沉淀细胞混合，到加生理盐水至25mL，使沉淀细胞充分悬浮。另取1支离心管，加入淋巴细胞分离液20mL，用滴管将血细胞悬液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。2.2000rpm/min离心20min后，从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、外周血单个核细胞层（PBMC层）、血浆层。用吸管将PBMC层吸出，转移至另一支离心管中。3.加生理盐水至40mL，1500rpm/min离心5min，结束后弃上清

8、，将沉淀细