hiv vpr上调nkg2d的配体和介导nk细胞毒效应的研究

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1、万方数据中图分类号UDCR512．91610硕士学位论文学校代码10533密级公珏HIVvpr上调NKG2D的配体和介导NK细胞毒效应的研究HIVvprup．-regulatesexpressionofligandsfortheactivatingNKG2DreceptorandpromotesNKcell--mediatedkilling作者姓名：王红燕学科专业：临床医学学院(系、所)：湘雅二医院指导教师：郑煜煌教授论文答辩日期竺丝：!：乡)答辩委员会主中南大学二O一四年五月万方数据学位论文原创性声明本人郑

2、重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：呈够学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以公布本学位论文的全部或部分内容

3、，可以采用复印、缩印或其它手段保存本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：日期：望盟年草月驷新签名型幽日期：丛年李月驺万方数据摘要HIVvpr上调NKG2D的配体和介导NK细胞毒效应的研究背景：病毒蛋白R(virusproteinR，vpr)是人免疫缺陷病毒(humanimmunodefifiencyvirus，mV)基因组的4个辅助基因之一。vpr基因产生的Vpr蛋白在HIV感染宿主细胞的过程和艾滋病(acquire

4、dimmunodefifiencysyndrome，AIDS)的发病机制中起重要作用。它参与病毒整合前复合体的核转运，激活病毒的转录过程，诱导细胞周期的G2／M期停滞，促进感染细胞凋亡。NKG2D是NK细胞表面主要的活化型受体之一，与其配体ULBPs结合后传导活化信号，诱导NK细胞毒效应以杀伤靶细胞。本文将研究HIV-1Vpr对ULBPs表达的影响，证实vpr基因是激活NKG2D的配体并介导NK细胞毒效应的病毒因素之一。目的：体外细胞实验观察转染了HIVvpr基因的jurkat细胞表面的NKG2D配体ULBP

5、l和ULBP2的表达情况，印证本研究室前期观察的HIV感染者CD4+T淋巴细胞表面的NKG2D配体ULBPl和ULBP2较正常人上升的实验结果；细胞毒实验中以抗体封闭NK细胞表面的NKG2D受体后，观察其对vpr表达阳性的jurkat细胞杀伤力的变化，探索HIV-1Vpr可能通过调节NKG2D配体的表达，激活NK细胞毒效应杀伤CD4+T淋巴细胞的分子机制。本研究将有助于进一步阐明HIV-1的致病机制，为艾滋病的治疗寻找新的有效分子II万方数据靶点打下基础。方法：目的基因HIV-1vpr来自BSXCⅥ，Ⅵ开RX

6、CTHY质粒。送质粒DNA测序以鉴定vpr片段的基因系列。将vpr用脂质体转染法转染至急性T细胞白血病细胞株jurkat细胞，用含1640和胎牛血清的培养基培养三天后，RT-PCR检测目的基因mRNA水平的表达。流式细胞术检测转染了vpr基因、转染了空载体和未转染的jurkat细胞表面ULBPl／ULBP2配体双阳性表达水平。密度梯度离心法从外周静脉血中分离单个核细胞(PBMC)，磁珠分选出NK细胞(CD56阳性细胞)，台盼兰染色计数活细胞后，以来自健康正常人和HIV-1感染者的NK细胞和NKG2D抗体封闭的

7、NK细胞为效应细胞，以转染了vpr基因和未转染vpr和PCD基因的jurkat细胞为靶细胞，效靶比为：9：1，通过细胞毒实验比较效应细胞对靶细胞的杀伤作用。结果：DNA测序结果表明BSXCYPln伊RXC删质粒携带的DNA片段与HIVvpr已知基因序列完全一致；用脂质体转染法将vpr基因片段和PCD空载体分别转染至jurkat细胞，RT-PCR检测到目的基因vpr的表达。流式细胞术检测到转染了vpr基因的jurkat细胞表面ULBPl／ULBP2配体双阳性表达水平较未转染vpr基因的细胞升高。细胞毒实验表明N

8、KG2D封闭后的NK细胞对jurkat细胞的杀伤力下降；来自HIV感染者的NK细胞对iurkat细胞杀伤力低于来自正常人的NK细胞。结论：1．转染了HIVvpr基因片段的jurkat细胞表面ULBPl／ULBP2受体双阳性表达水平较PCD转染组和空白组的表达III万方数据水平升高，提示HIV-1Vpr能上调jurkat细胞表面NKG2D配体的表达，通过体外细胞实验证实了本研究室之前的临床研究结果：H