wee1gfp在ctl介导的细胞毒效应中的作用研究

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1、Wee1GFP在CTL介导的细胞毒效应中的作用研究【摘要】　　目的:研究Wee1GFP融合蛋白对胞毒T细胞介导的胞毒效应的影响。方法:采用脂质体将融合基因Wee1GFP导入鼠胰岛瘤细胞(NIT1)并检测其表达。以转染pWee1GFP和空载体的NIT1为靶细胞,采用ELISA凋亡试剂盒和乳酸脱氢酶法检测胞毒T细胞介导的细胞毒效应。结果:Westernblot检出Wee1GFP融合蛋白的表达。转染Wee1GFP的靶细胞发生凋亡及损伤的细胞数比转染空载体的靶细胞少。结论:Wee1GFP基因转染靶细胞具有一定的抵抗CTL介导的胞毒效应的能力

2、。【关键词】凋亡Wee1细胞毒效应　　近年来,胰岛细胞移植治疗糖尿病正日益受到人们关注。无论是1型糖尿病还是2型糖尿病都存在胰岛β细胞的衰竭问题。在糖尿病的自然病程中,胰岛β细胞功能的持续恶化是一个不可逆的过程,采用胰岛细胞移植治疗糖尿病可能成为恢复胰岛β细胞功能以根治糖尿病的一个重要手段。然而组织来源不足限制了胰岛细胞移植的广泛开展,因而再造分泌胰岛素的克隆细胞并进行移植以重建胰岛细胞功能,为糖尿病治疗提供新的研究方向,而胰岛细胞移植同样面临免疫排斥的问题。杀伤性T细胞的杀伤机制在器官移植排斥反应发挥重要作用[1],本研究将Wee1GFP基因导入

3、胰岛瘤细胞株NIT1细胞,9以研究该融合蛋白在胞毒T细胞介导细胞毒效应机制中的作用。　　1材料和方法　　1.1材料MTT(Sigma公司);乳酸脱氢酶（LDH）底物溶液（Roche公司）;ELISA凋亡检测试剂盒（Roche公司）;脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen);核蛋白提取试剂盒（南京凯基生物）;重组质粒pCMVWee1/GFP（华中科技大学同济医学院免疫学系惠赠）;质粒pKENGFP(本室保种);NIT1细胞株（小鼠胰岛瘤细胞株,澳大利亚WEH1实验室惠赠,本室保存）;8周龄BALB/c小鼠（暨南大学医

4、学院实验动物中心）。　　1.2方法　　1.2.1基因转染和筛选将NIT1细胞接种于6孔培养板,细胞数3×105/孔,培养24h,80%细胞融合,按LipofectamineTM2000试剂说明书方法将质粒pWee1GFP及空载体pKENGFP分别导入NIT,转染后48h加入G418(500mg/L)进行筛选,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况。转染pWee1GFP的NIT记为NITwg,转染pKENGFP的NIT记为NITg。　　1.2.2Westernblot检测蛋白的表达收集培养的NITw9g细胞和NITg细胞,弃去培养液,细

5、胞用预冷的PBS洗涤2遍,按照KEYGENNuclearCytosolExtraction试剂盒提取细胞核蛋白质。采用兔抗人Wee1多克隆抗体进行Westernblot检测Wee1的表达。　　1.2.3效应细胞的制备体外混合细胞培养制备效应性T细胞:将NIT1细胞（1×109/L）用丝裂霉素C处理,终浓度30mg/L,37℃1h后与小鼠脾脏单个核细胞（MSMC）于24孔板中混合培养（2mLRPMI1640培养液含1×107鼠MSMC,1×106NIT1细胞,IL250U/mL,ConA5mg/L）,6d后收集淋巴细胞,记为鼠TcA。体内外联合

6、免疫小鼠制备效应性T细胞:取BALB/c小鼠,腹腔注射NIT1细胞2次,第1次注射1×107（0.5mL）细胞,间隔2周同量再注射1次,5d后分离小鼠MSMC作为反应细胞。以丝裂霉素C处理的NIT1细胞为刺激细胞,按上法进行混合细胞培养,6d后收集鼠淋巴细胞,记为鼠TcB。　　1.2.4ELISA检测细胞凋亡以上述鼠TcA和鼠TcB为效应细胞,以NITwg和NITg细胞为靶细胞,效靶比为12.5∶1,按ELISA凋亡检测试剂盒方法检测效应细胞诱导的细胞凋亡。以下列公式计算细胞释放的单或低聚核小体特别聚集值:聚集因子=实验孔的mU/对照孔的mU;m

7、U=双孔平均A值－底物A值;注:mU=吸收值(10-3)。　　1.2.5LDH法测定胞毒T细胞介导的细胞毒作用9以鼠TcA和鼠TcB为效应细胞,以NITwg及NITg为靶细胞,效靶比为12.5∶1分别加入96孔板,同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组,采用乳酸脱氢酶（LDH）法进行检测,根据公式计算细胞杀伤率:细胞杀伤率=[（实验组平均A值－自然释放对照组A值）/（最大释放对照组A值－自然释放对照组A值）]×100%。　　1.2.6统计学处理本实验采取未配对资料的t检验进行分析。　　2结果　　2.1融合蛋白的荧光表达检测细胞转染重组质粒pWee

8、1GFP后48h用相差荧光显微镜观察,可见NIT1细胞内有绿色荧光蛋白表达（图1）。　　图1转染pWee