wee1gfp在ctl介导的细胞毒效应中的作用研究

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1、Wee1GFP在CTL介导的细胞毒效应中的作用研究【关键词】凋亡TT(Sigma公司);乳酸脱氢酶（LDH）底物溶液（Roche公司）;ELISA凋亡检测试剂盒（Roche公司）;脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen);核蛋白提取试剂盒（南京凯基生物）;重组质粒pCMV2000试剂说明书方法将质粒pSMC）于24孔板中混合培养（2mLRPMI1640培养液含1×107鼠MSMC,1×106NIT1细胞,IL250U/mL,ConA5mg/L）,6d后收集淋巴细胞,记为鼠TcA。体内外联合免疫小鼠制备效应性T细胞:取BALB/c小鼠,腹腔注射NIT

2、1细胞2次,第1次注射1×107（0.5mL）细胞,间隔2周同量再注射1次,5d后分离小鼠MSMC作为反应细胞。以丝裂霉素C处理的NIT1细胞为刺激细胞,按上法进行混合细胞培养,6d后收集鼠淋巴细胞,记为鼠TcB。　　1.2.4ELISA检测细胞凋亡以上述鼠TcA和鼠TcB为效应细胞,以NITU/对照孔的mU;mU=双孔平均A值－底物A值;注:mU=吸收值(10-3)。　　1.2.5LDH法测定胞毒T细胞介导的细胞毒作用以鼠TcA和鼠TcB为效应细胞,以NITwg及NITg为靶细胞,效靶比为12.5∶1分别加入96孔板,同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组,采用乳酸脱氢酶（

3、LDH）法进行检测,根据公式计算细胞杀伤率:细胞杀伤率=[（实验组平均A值－自然释放对照组A值）/（最大释放对照组A值－自然释放对照组A值）]×100%。　　1.2.6统计学处理本实验采取未配对资料的t检验进行分析。　　2结果　　2.1融合蛋白的荧光表达检测细胞转染重组质粒pWee1GFP后48h用相差荧光显微镜观察,可见NIT1细胞内有绿色荧光蛋白表达（图1）。　　图1转染pWee1GFP的荧光表达检测（略）　　A:转染pWee1GFP的NITwg细胞;B:未转染质粒的NIT细胞.　　2.2Westernblot检测融合蛋白的表达将pWee1GFP和空载体分别导入NIT

4、1细胞,并通过G418筛选获得稳定表达细胞后,采用Westernblot分析融合蛋白Wee1GFP的表达情况。转染融合基因pWee1GFP的NITwg细胞可见特异性条带,而转染空载体的NITg细胞则未见阳性条带（图2）。　　图2Westernblot检测Wee1GFP的表达（略）　　2.3NIT刺激前后淋巴细胞增殖的形态学变化NIT刺激前的淋巴细胞体积较小,多分散存在,未见细胞成团现象（图3A）。NIT刺激后的淋巴细胞（图3B）,混合NIT淋巴细胞培养后,可见淋巴细胞活化、增殖,有成团现象。　　图3NIT刺激前、后淋巴细胞增殖的形态学分析（略）　　A:刺激前的淋巴细胞;B:刺激

5、后的淋巴细胞.　　2.4融合蛋白,HenkartPA.Perforinandthegranuleexocytosiscytotoxicitypathmunol,2003,15(5):522-527.　　[4]ChenG,ShiL,LitchfieldDurineplantationstagesofembryonicdevelopment[J].IntJBiolSci,2006,2(4):161-170.　　[6]KelloggDR.echanismsrequiredforcoordinationofcellgrowthandcelldivision[J].JCellSci,2003,

6、116(Pt24):4883-4890.