gankyrin介导的去分化在肝癌发生发展中的作用研究

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1、第二军医大学博士学位论文Gankyrin介导的去分化在肝癌发生发展中的作用研究姓名：孙文申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：王红阳201205Gankyrin介导的去分化在肝癌发生发展中的作用研究摘要第—部分研究背景和目的原发性肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中排名第六，死亡率则居第三。原发性肝癌中肝细胞癌是最常见的类型。肝细胞癌的发生机制较为复杂，主要包括各种致病因素(乙型／丙型肝炎病毒感染、酒精滥用、非酒精性脂肪肝等)引起的肝脏长期慢性炎症与硬化。肝细胞癌的高度异质性导

2、致难以单独采用化疗清除癌细胞，同时手术切除和肝移植也仅限于早期诊断的肝癌。由于大多数肝癌患者诊断时已是中晚期，并且术后频频复发转移，导致肝癌患者的预后较差。肝癌的发病率高、死亡率高、并且缺乏有效的治疗手段，因此研究肝癌发生的机制、探寻新的肝癌预防和治疗靶点就显得尤为重要。肝细胞去分化在肝癌进展的过程中扮演着重要的作用。肝细胞癌是一个复杂的异质物，其中包含着具有无限增殖潜能的未分化细胞群。近年来，随着对去分化研究的不断深入，通过诱导肝癌细胞分化来治疗肝癌已展现出一定的前景。评价肝癌的分化程度对于肝癌患者

3、的病理诊断、治疗策略的优化选择和预后评估都很关键。肝细胞结构与代谢功能的维持受到一系列肝富集核因子的交叉调控，这些核因子又称为肝细胞核因子(HNFs，Hepatocytenuclearfactors)，主要包括HNFla、HNF3p和HNF4a等。在HNF家族中，HNF40t与肝细胞功能和分化状态的维持有重要的联系，也有研究显示，在肝癌细胞中过表达HNF4a，可以在一定程度上诱导肝癌细胞向肝细胞分化。癌基因p28GANK，又名Gankyrin，也叫做26S蛋白酶体jIEATP酶亚基10(PSMDIO)

4、，最初发现在肝癌中特异高表达。随着对Gankyrin研究的不断深入，陆续发现它在肺癌、结肠癌等其他类型的恶性肿瘤中也存在高表达。前期研究发现Gankyrin可以与CDK4相互作用促进抑癌蛋白Rb的降解；Gankyrin也可以与MDM2直接结合从而促进MDM2依赖的p53泛素化和降解。近期研究显示，Gankyrin可以通过调控RhoA／ROCK信号通路促进肿瘤发生；另一方面，在DEN诱导的小鼠肝癌模型中，g-_军医大学博士学位论文Gankyrin通过促进C／EBPa泛素化降解促进肝癌的发生；另外本实验室

5、的研究也发现Gankyrin可以与RelA结合抑制NF．KB的活性；Gankyrin也能通过活化PI．3科Akt／HIFl0【通路促进Twistl、VEGF、MMP2的表达，从而使肝癌细胞发生EMT，促进肝癌的侵袭转移，影响肝癌病人的预后。而Gankyrin的表达与肝癌去分化之间的关系尚不清楚。因此，本课题研究Gankyrin与肝癌去分化之间的关系及可能的分子机制，有助于解释肝癌的发病机理，并为肝癌的分化治疗提供实验数据。研究方法：1．建立大鼠DEN肝癌诱导模型，收集不同病变阶段的大鼠肝脏标本2．建立

6、小鼠CCl4急性肝损伤模型3．采用Western．blot、Realtime．PCR、免疫组化等方法研究上述动物模型中Gankyrin及相关分化指标表达的变化4．在临床肝癌样本中利用免疫组化、Reaitime．PCR等方法，研究Gankyrin与去分化指标之间的关系5．构建Gankyrin相关的干扰及过表达质粒，包装腺病毒和慢病毒，建立稳定细胞系6．建立大鼠原代肝细胞分离模型，分离原代肝细胞并离体培养，用Gankyrin相关腺病毒进行刺激，研究Gankyrin诱导肝细胞去分化的作用7．利用CCK8、流

7、式、克隆形成、裸鼠荷瘤等方法，检测Gankyrin相关肝癌稳定细胞系的恶性表型变化8．采用Realtime．PCR、流式、免疫组织荧光、Spheroid形成实验等方法检测临床样本和肝癌稳定细胞系肝癌干细胞表型的变化9．利用免疫共沉淀、免疫组化等方法研究Gankyrin对肝细胞核因子的调控作用及机制研究结果：I．在CCi4诱导的小鼠急性肝纤维化．硬化模型中发现Gankyrin的表达增加；在大鼠DEN肝癌诱导模型中，GankyrinlYJ表达随着病变程度的加重而不断升高，并且与去分化相关指标的变化趋势一致

8、2．Gankyrin在临床样本中的表达与肝癌组织的分化程度负相关3．Gankyrin可以在体外诱导原代大鼠肝细胞去分化．2．Gankyrin介导的去分化在肝癌发生发展中的作用研究4．干扰肝癌细胞系中Gankyrin的表达可以抑制其恶性表型，诱导肝癌细胞分化，并减少干扰细胞系裸鼠皮下荷瘤成瘤5．干扰Gankyrin表达可以抑制肝癌干细胞表型6．Gankyrin通过诱导m虾4俚的降解促进了肝细胞和肝癌细胞的去分化，这种调控作用在体内实验和临床标本中均得到了证