ASPM调控Wnt_β-catenin信号通路介导肝癌发生的机制研究

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1、学校代码10459学号或申请号201512263049密级公开硕士学位论文ASPM调控Wnt/β-catenin信号通路介导肝癌发生的机制研究作者姓名：李智慧导师姓名：张海风副教授学科门类：理学专业学位名称：生物化学与分子生物学培养院系：基础医学院完成时间：2018年5月Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterASPMPromotesHepatocarcinogenesisThroughWnt/β-CateninSi

2、gnalingPathwayByZhihuiLiSupervisor:Prof.HaifengZhangDepartmentofBiochemistryandMolecularBiologySchoolofMedicalSciencesMay,2018ASPM调控Wnt/β-catenin信号通路介导肝癌发生的机制研究研究生：李智慧导师：张海风副教授郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学系河南郑州，450001摘要肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展是一个与多种基因的异常改变相关的复杂过程，迄今具体的分子机制尚不完

3、全清楚。人类异常纺锤体样小头畸形相关蛋白基因(HumanAbnormalSpindle-likeMicrocephaly-associated,ASPM），位于染色体1q31，全长62528bp,编码区长10434bp，由28个外显子构成。最初发现其在胚胎期神经形成中起关键作用，控制大脑的容量，其基因突变与神经发育缺陷性的常染色体隐性遗传小头畸形的主要原因发病相关。随着研究的深入，发现ASPM在增殖旺盛的组织及肿瘤组织中高表达。我们前期实验结果发现ASPM在肝癌组织中表达水平明显上调，由此，我们推测ASPM可能参与肝

4、癌的发生、发展。经典的Wnt/β-catenin信号在大多数的肝癌中都异常活化，我们前期研究发现，ASPM在肝癌组织中的表达水平与β-catenin的表达水平显著相关。基于此，我们提出ASPM可能通过调控Wnt/β-catenin信号途径影响肝癌的发生发展。本课题主要从两个方面进行研究：（1）ASPM在肝癌组织与癌旁组织中的表达水平、临床病理学意义及其与Wnt/β-catenin信号通路中重要开关分子的关系；（2）ASPM对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制研究。I方法1人肝组织中ASPM的表达水平及临床病理学意义

5、研究1.1应用RT-qPCR法检测肝癌及癌旁组织中ASPMmRNA的表达水平，分析ASPM在肝癌及癌旁组织中的表达水平及与临床病理学意义；1.2应用WesternBlotting及免疫组化方法检测肝癌及癌旁组织中ASPM蛋白的表达水平，分析ASPM蛋白在肝癌及癌旁组织的水平；1.3应用RT-qPCR法检测肝癌及癌旁组织中Wnt/β-catenin信号通路中重要开关分子mRNA的表达水平，分析ASPM与Wnt/β-catenin信号通路中重要开关分子mRNA表达水平的相关性。2ASPM对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及机

6、制研究2.1应用RT-qPCR方法检测肝癌细胞株中ASPM的表达水平，筛选出干扰效果最优shASPM序列，构建慢病毒介导的ASPM-shRNA肝癌细胞株；2.2用CCK-8、划痕修复、Transwell实验方法检测稳定沉默ASPM对肝癌细胞增殖能力、迁移能力以及侵袭能力的影响；2.3运用WesternBlotting技术检测稳定沉默ASPM及对照组中Wnt/β-catenin信号通路中Dvl-2、β-catenin、TCF4、LEF1的蛋白表达水平。结果1人肝组织中ASPM表达水平及临床病理学意义1.1人肝组织中AS

7、PMmRNA的表达水平及临床病理学意义利用RT-qPCR的方法，对102例人肝标本ASPMmRNA进行定量，其中肝癌组织和非癌组织各96例，配对的癌与癌旁组织90例。结果显示肝癌组织中ASPMmRNA表达水平显著高于癌旁组织（P<0.00001）。90例配对的样本中，69例肝癌组织ASPM高表达，高表达率为76.7%。对102例肝癌组织及癌旁组织按照肿瘤大小、肝硬化程度、AFP表达水平分组分析ASPMmRNA表达差异，结果显示，各分组中癌组织均显著高于癌旁组织（P<0.05）。值得注意的是，患者AFP在正常范围（AF

8、P≤20ng/mL），肝癌组织中ASPMmRNA表达水平依然显著高于癌旁组织（P=0.048）。根据有无癌栓、有无血管侵犯、肿瘤分化程度分析发现，发生癌栓、有血管侵犯、中分化及低分化组，肝癌组织中ASPMmRNA表达水平显著高于癌旁组织（P≤0.01）。而高分化，无癌栓及无血管侵犯组肝癌组织ASPMmRNA表达水平与癌旁组织II相比无统计学意义