艾灸肺俞、膏肓俞对肺纤维化大鼠Wnt_β-catenin信号通路的调控效应研究

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1、成都中医药大学(基础医学院）二0一七届硕士研究生学位论文艾灸肺俞、膏肓俞对肺纤维化大鼠Wnt/β-catenin信号通路的调控效应研究RegulationEffectsoftheWnt/β-cateninPathwayofPulmonaryFibrosisRatsThroughMoxibustionoftheFeishuandGaohuangshuPoints研究生姓名：李婧指导教师：丁维俊教授学科专业：病原生物学二○一七年五月万方数据学位论文艾灸肺俞、膏肓俞对肺纤维化大鼠Wnt/β-catenin信号通路的调控效应研究RegulationEffectsoftheWnt/β-c

2、ateninPathwayofPulmonaryFibrosisRatsThroughMoxibustionoftheFeishuandGaohuangshuPoints李婧指导教师姓名：丁维俊教授申请学位级别：硕士专业名称：病原生物学论文提交时间：2017-03论文答辩时间：2017-05二○一七年五月万方数据成都中医药大学2017届硕士研究生学位论文中文摘要目的：艾灸治疗肺纤维化有一定疗效优势，但仍缺乏系统深入的生物学机制研究。本课题采用艾灸肺俞、膏肓俞治疗肺纤维化模型大鼠，观察在肺纤维化疾病进程中Wnt/β-catenin信号通路对肺上皮-间质的转变作用，以及艾灸治疗对该

3、通路关键因子的表达调控，进一步揭示艾灸治疗肺纤维化的分子调控机制。方法：选用2月龄SPF级SD雄性大鼠100只，体重180±20g。将大鼠随机分为4组：正常对照组（N）、模型组（M）、艾灸治疗组（A）、泼尼松治疗组（P）。除正常对照组按造模方法予以气管内一次性注射等体积的生理盐水外，其余组均予以气管内一次性注射博来霉素5mg/kg复制肺纤维化模型。从造模后第2天开始治疗，艾灸治疗组予以着肤灸肺俞、膏肓俞二穴，采用着肤灸左右交替施灸，每穴3壮，每壮5mg，每天一次；泼尼松治疗组每日予以泼尼松5mg/kg灌胃，模型组采用与治疗组相同的抓取固定方法进行干预，正常对照组不做任何干预。逐

4、日观察并记录大鼠的呼吸、体重、精神状态等一般情况。分别于造模后第7天、第11天、第23天、第35天取材，动态观察各组肺纤维化过程中Wnt/β-catenin信号通路关键因子的表达水平。HE染色和Masson染色法观察肺组织病理变化。免疫组化法检测各组肺组织β-连环蛋白（β-catenin）表达变化。酶联吸附反应法（ELISA法）检测肺组织中β-catenin、Wnt诱导分泌蛋白-1（WISP-1）、金属基质蛋白酶-7（MMP-7）、Wnt-3a等蛋白含量。实时荧光定量PCR法检测各组β-catenin、Wnt-3amRNA的表达水平。蛋白质印迹法（westernblot法）检测

5、WISP-1、MMP-7蛋白在各组肺组织的表达水平。结果：艾灸组大鼠的一般情况及呼吸状况有明显改善。模型组大鼠与正常组大鼠比较一般情况较差，体重增长缓慢，呼吸急促。与同时段模型组相比，艾灸组大鼠的呼吸、体重等一般情况指标明显改善。病理学观察下艾灸组大鼠肺组织炎性细胞浸润和纤维化程度明显减轻。HE染色镜下观察可见：模型组肺间质中炎性细胞浸润明显，肺间质增宽。艾灸组与同时间点模型组比较，肺组织炎性细胞浸润程度明显降低（P<0.05）。Masson染色镜下观察模型组胶原纤维明显增生。艾灸组与同时间点模型组比较纤维增生程度明显减低（P<0.05）。模型组肺组织中Wnt/β-cateni

6、n信号通路关键因子表达明显升高。模型组中肺组织β-catenin表达明显升高，在23天时达到高峰后下降，与正常对照组比较均I万方数据成都中医药大学2017届硕士研究生学位论文具统计学意义（P<0.05）。模型组各时间点大鼠肺组织Wnt3a表达升高，在11天时达到最高峰，随后略有下降，与正常组比较均具有显著统计学差异（P<0.01）。模型组中MMP-7的表达逐渐升高，与正常组相比具有显著统计学意义（P<0.01）。模型组WISP-1的表达逐渐上升，在11天、23天、35天均高于正常组，具统计学差异（P<0.05）。艾灸治疗能显著降低Wnt/β-catenin信号通路关键因子的表达

7、。免疫组化法检测β-catenin，A11组与M11组相比具有统计学意义（P<0.05），A23天组与M23组比较具有显著统计学意义（P<0.01），但A35组与M35组比较不具有统计学差异；QPCR法检测β-cateninmRNA表达结果发现，A23组与M23组相比具显著统计学差异（P<0.01），A35天时艾灸组与模型组比较具有统计学差异（P<0.05），同时间点艾灸组与泼尼松组比较无统计学差异(P>0.05)。艾灸各组Wnt3a的表达均低于同时间段模型组，在11天时具显著统计学意义（P