calpain-2核转位介导肥大心肌细胞凋亡-(5297)

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1、第四军医大学硕士学位论文InsP3Rinositol1,4,5-trisphosphatereceptor三磷酸肌醇受体IP3inositoltriphosphate三磷酸肌醇kDaKilodalton千道尔顿LTCCL-typecalciumchannelL-型钙离子通道LVHleftventricularhypertrophy左心室肥厚+2+NCXNa/Caexchange钠钙交换体NF-κBnuclearfactor-kappaB核因子-κBNLSnuclearlocationsignal核定位信号PAGE

2、polyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应PLCphospholipaseC磷脂酶CPVDFpolyvinylidenedifluoride聚偏二氟乙烯RyRryanodinereceptor雷诺定受体reversetranscriptionpolymerasechain逆转录聚合酶链式反RT-PCRreaction应SDSsodiumdodec

3、ylsulfate十二烷基硫酸钠2+2+SERCAsarcoplasmicreticulumCa-ATPase肌质网Ca-ATP酶SRsarcoplasmicreticulum肌质网TACtransverseaorticconstriction腹主动脉缩窄TBStriethanolamine-bufferedsaline三乙醇胺缓冲盐溶液TUNELtransferase-mediatednick-endlabeling缺口末端标记法2第四军医大学硕士学位论文Calpain-2核转位介导肥大心肌细胞凋亡硕士研究生：

4、圣娟娟导师：余志斌教授第四军医大学航空航天生理学教研室，西安710032中文摘要【引言】长期慢性高血压可引起心肌肥厚，早期呈代偿性心肌收缩力增强，随着心室的重构，心肌肥厚就会向心衰转化。心肌细胞的凋亡在其中扮演着重要角色，甚至在代偿性心肌肥厚早期，肥大的心肌细胞在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的作用下凋亡率就会增高，即肥大的心肌细胞凋亡易感性升高，但是其具体机制尚不清楚。探讨肥大心肌细胞凋亡易感性增加的机制可为预防心肌肥厚向心衰转化提供理论依据。研究证实心肌细胞在肥大的过程中钙依赖性蛋白酶（calpain）活性增加，促

5、进肌节蛋白的更新；同时钙/钙调蛋白激酶ⅡδB活性增高，促进肌节蛋白的转录与合成，二者共同作用促进心肌细胞的肥厚。我们在实验中观察到在肥大的心肌细胞中calpain-2向细胞核转位，可能参与调节肥大心肌细胞的凋亡。因此，本实验利用腹主动脉缩窄高血压大鼠模型来模拟高血压性心肌肥厚，比较了肥大心肌细胞与正常大鼠心肌细胞的异同点，认为calpain-2被激活核转位降解CaMKⅡδB可能是肥大心肌细胞凋亡易感性增加的分子机制之一。【目的】1制作腹主动脉缩窄高血压大鼠模型（TAC）并观察心肌肥厚情况。3第四军医大学硕士学位论

6、文2观察AngⅡ对CON组和TAC组心肌细胞凋亡率的影响。2+3观察CON组与TAC组心肌细胞内Ca浓度的变化。4观察CON组与TAC组心肌细胞内calpain-2定位、活性的变化。5观察CON组与TAC组心肌细胞核内CaMKⅡδB的变化。6观察CON组与TAC组心肌细胞内Bcl-2的表达变化情况以及线粒体膜电位和细胞色素c的释放情况。【方法】本实验采用腹主动脉缩窄高血压大鼠模型模拟长期慢性后负荷增加导致的心肌肥厚，用心脏B超观察心肌肥厚程度和心功能的变化，原位凋亡检2+测心肌细胞凋亡率，用钙荧光探针Fluo3/

7、AM标记细胞内游离的Ca，结合2+激光共聚焦显微镜观察Ca浓度的变化，细胞免疫荧光技术和WesternBlot技术检测calpains、CaMKⅡδB、Cytoc等蛋白质的定位和表达情况。用免疫共沉淀技术检测calpain-2和CaMKⅡδB之间的相互关系。用Real-TimePCR检测左心室心肌中Bcl-2mRNA的表达水平。用线粒体膜电位荧光探针JC-1结合激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化。细胞免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术观察Cytoc的分布形式来反映Cytoc的释放情况，线粒体内的Cytoc呈规则

8、的颗粒状分布。【结果】1腹主动脉缩窄16w大鼠心肌出现肥厚，凋亡易感性明显增加采用心脏B超观察模型组心肌肥厚程度，显示腹主动脉缩窄16w后心脏室间隔和后壁明显肥厚，短轴缩短率（FS）增大，射血分数（EF）升高，心脏呈现代偿性肥厚。TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡率，发现TAC组心肌细胞凋亡率并未明显高于CON组；经AngⅡ作用后，TAC组凋亡率则明显高于CON组；钙蛋白酶