秦岭黑麦75kγ-secalin基因克隆及序列分析

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1、类似于小麦中的醇溶蛋白和谷蛋白和大麦中hordein蛋白，但是编码它们的基因在染色体上的分布存在差异。其中，I-IMWsecalin(包括X．和Y．两种类型)由1R染色体长臂上的位点控制，40k7-secalin和∞．secalin由位于1R染色体短臂上的位点控制，而75KY．secalin由2R染色体短臂上的位点控制(Charbonnierela1．1981；LawrenceandShepherd1981；Shewryeta1．1982；Kasardaeta1．1983；Shewryeta1．1984；Murrayet

2、a1．2001)。Amiour等(2002a,b)对欧洲小黑麦75K7-secalin进行了SDS．PAGE研究表明，该基因具有d1、d2、tl和null四种等位变异形式。在黑麦上述的主要储藏蛋白中，75K7-secalin亚基约占黑麦碱储藏蛋白的50％(Shewryeta1．，1983a，b)，且富含谷氨酸和脯氨酸(Shewryela1．，1982)，依靠分子间二硫键形成聚合体(MnllerandWieser1997；KippandWieser1999；DeBustosandJouve2003)。Amiour等(200

3、2a，b)对欧洲小黑麦75K7-secalin进行了SDS．PAGE研究，证实该基因存在等位变异。Gupta等(1989)研究小麦．栽培黑麦易位系2RS．2BL发现，该易位系在增加籽粒产量的同时会影响面团加工品质，表明75K3t-secalin亚基可能在小麦品质改良中有潜在的价值。弄清75K7-secalin亚基编码基因的结构特征及分子水平上的遗传多样性，可为更好利用75K1,-secalin亚基进行品质育种提供重要参考。ShewryandField(1982)、MUllerandWieser(1997)等曾对secal

4、in或者丫-secalin亚基的氨基酸一级结构进行了分析。Murray等(2001)首先从一个栽培黑麦(＆cereale)克隆出了75K7-secalin亚基编码基因。Chen等(2007)分别从&montanum、＆vavilovii、&silvestre和＆cereale克隆了4个75K7-secalin基因。通过对这5个基因序列比较发现，成熟的75研．secalin亚基由19个完全保守的氨基酸残基组成的信号肽(SignalPeptides)、20个完全保守肽段组成的N·末端区(N．terminalRegion)、变

5、异的重复区和C．端四部分构成，起聚合作用的半胱氨酸分布在N．端和C．端(C-termialRegion)，并发现＆sylvestre的75KY．secalin亚基重复区中发现特有的一个半胱氨酸残基(Cheneta1．，2007)。重复区段(RepetitiveRegion)，该区域又可以划分为两个具有不同重复亚基类型的RepeatsA区和RepeatsB区。其中，C．端RepeatsA区是由124个氨基酸残基构成的短肽链，是该编码序列中氨基酸变异最为活跃的区2域。RepeatsB区由136个氨基酸残基构成，该区段相对稳定

6、。由156个氨基酸残基组成，含有8个半胱氨酸残基(Cysteine)，为该基因编码区半胱氨酸残基最富集区，且在数目及相对位置上具有较为强烈的稳定性。2立题依据目前，用于小麦改良的主要是栽培黑麦。迄今，NCBI数据库仅获得了两例栽培黑麦的75K’,-secalin基因序YlJ(Murrayeta1．，2001；Cherteta1．，2007)，一个是来自南非开普敦的栽培黑麦材料P1412949的基因序列(NCBI编号为EF432547)；来自欧洲的帝国(Imperial)黑麦的基因序列(NCBI编号为AF201084)。栽

7、培黑麦75KT-secalin亚基编码基因的遗传多样性信息还需要进一步研究。目前，还没有中国栽培黑麦的75K7-secalin亚基编码序列的研究报道。秦岭黑麦是我国的一个栽培品种，对白粉病、条锈病免疫(30登才等2002)。本研究拟克隆秦岭黑麦的75K7-secalin编码基因，并与在地理分布上差异大的已知栽培黑麦及其它黑麦种的相应基因进行比较分析，为该基因的发掘利用提供参考。3材料与方法3．1材料供试材料秦岭黑麦及中国春．帝国黑麦2R染色体附加系(CS．2R)由四川农业大学小麦研究所舒焕麟副研究员收集；克隆用大肠杆菌菌

8、株DH50t保存在四川农业大学小麦研究所分子实验室；ExTaq、dNTP、MgCl2、pMDl$-T载体、各类限制酶等试剂购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRaCo．)，DNA纯化、回收试剂盒购自OMEGA公司。3．2方法3．2．1种子蛋白提取蛋白提取缓冲液：70mmol／LTris·HClpH6．82％(W／V)