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1、热和酸应力条件下脂环酸芽孢杆菌Dnak基因克隆和序列分析DNA基因克隆及序列分析。通过兼并PCR基因组扩增获得了大约1300bp的基因片段，然后子克隆到PMD-18T载体上测序。BLAST基因组数据库搜索表明，此PCR产物的序列共享原核热休克蛋白70DNAK基因，与来自脂环酸芽孢杆菌LAA1伴侣蛋白的DNAK基因的同源性是最高的（92%）。通过基因组步移技术测定DNAK基因（基因组数据库登录号HQ893543），包含1854bp完整的开放阅读对话框（ORF），编码617个氨基酸。推知的氨基酸序列与来自A.acidocaldari
2、usLAA1(86%)的DNAK基因表达的伴侣蛋白的相似性最高，与来自Bacillustusciae,Paenibacillussp.Y412MC10,Thermosinuscarboxydivorans,Brevibacillusbrevis的A.acidocaldarius的相似性分别为83%,77%,76%,75%。没有检测到信号肽。预测分子量是(Mw)是66.2KDa，等电点（pI）是4.82.氨基酸序列比对和主题搜索结果显示，在这个基因中有3个域：N末端核苷酸结合域(NBD,aa1–360)类似于肌动蛋白ATP酶结构域
3、，它包括三个保存位点(-I-D-L-G-T-T-N-S-,-V-F-D-L-G-G-G-T-F-D-V-S-I-L-,和V-I-L-V-G-G-S-T-R-I-P-A-V-Q-E)，它可能与ATP绑定和激活有关；aa360–517组成C-末端底物结合域(SBD);aa-484–617组成的C-末端子域，它可能和底物的结合和释放有关。脂环酸芽孢杆菌在不同的培养温度下DNAK基因的表达。脂环酸芽孢杆菌生长的温度范围从20°C-60°C，最适生长温度为45-50°C。在这项研究中，脂环酸芽孢杆菌DSM3922T在45°C中活跃培养16
4、小时，分别在20°C,25°C,30°C,35°C,40°C,45°C,50°C,55°C和60°C繁殖生长。根据观察脂环酸芽孢杆菌在温度为30°C,35°C,40°C,45°C,50°C和55°C正常生长。在55°C和30°C生长时，分别繁殖8小时和10小时时达到对数生长期。然而，在培养温度为20°C，25°C或者60°C时，芽孢生长及其缓慢，与其他处理组像比较很难进入指数生长期。值的注意的是，在繁殖温度为20°C，25°C和60°C时没法收集到足够的细菌ＲＮＡ用于分离和表达分析。如图２所示，ＤｎａＫ在培养温度为30°C,35
5、°C,40°C,45°C,50°C和55°C的基本表达情况。在脂环酸芽孢杆菌最适生长温度(40–55°C),其表达水平相对稳定。在较低的温度下，30°C和35°C,Ｄｎａｋ的表达大幅升高。这表明Ｄｎａｋ可能参与脂环酸芽孢杆菌对不良环境的适应。在热应力条件下脂环酸芽孢杆菌DNAK的表达。在实验中，热应力加在45°C繁殖生长到指数生长期摇瓶菌悬液内的细菌上，然后置于温度分别为70°C,80°C,90°C的恒温浴内。在80°C和90°C时，开始10分钟内，细菌正常生长，15分钟后细胞开始破裂。随着热应力的继续，有明显的细胞裂解和细胞凋
6、亡的进一步加剧。在80°C,和90°C时仅仅热应力持续5分钟和10分钟，提取的RNA适合做进一步分析，热冲击15分钟或更长时间，提取的RNA严重退化，不能用于ＲＴ－ＰＣＲ分析。当孵育温度70°C热冲击，所有的时间范围内细菌维持正常生长，全部的RNA被分离用于ＲＴ－ＰＣＲ检测。正如图３所示，以70°C的热冲击温度，与对照在不孵育的脂环酸芽孢杆菌相比，ＤＮＡＫ的表达水平在孵育５分钟增加了４０％，长时间的热冲击，表达水平下降，与对照的相比２５分钟孵育的细菌ＤＮＡＫ表达水平提高了３０％，当热休克在80°C和90°C时，与对照相比，在5分
7、钟内细菌的DNAK表达水平高速增加70%和15%。有人指出，随着热冲击温度的上升，DNAK表达水平上升，这显示了脂环酸芽孢杆菌对耐热性可能与DNAK有关。酸性条件下脂环酸芽孢杆菌DNAK基因的表达。正如图所示，在酸胁迫条件下，Dnak的表达水平在1小时内迅速增加，直到5小时大幅下降。DnaK的表达水平高于开始在酸胁迫条件下（对照组），在半小时和一小时内表达为对照组的2.5倍和3.3倍。随着酸胁迫的继续，Dnak的表达水平在2小时内下降到40%，在3小时时为对照组最小量的8%，这表明，Dnak基因可能调节脂环酸芽孢杆菌的的耐酸性。
8、讨论Hsp70是已知的进化上最保守的蛋白质。包括Dnak，Hsc66，Hsc62。热休克蛋白70家族被发现在原核生物体内,Dnak被广泛的分析。作为一个组成型的伴侣蛋白，可以上调热休克在高温条件下，他对蛋白质的折叠和细胞存活，生长至关重要。像其热休克蛋白70家族
