致倦库蚊Cecropin基因克隆及序列分析.doc

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1、致倦库蚊Cecropin基因克隆及序列分析【摘要】　　目的：克隆致倦库蚊Cecropins基因序列，并进行生物信息学分析。方法：选取致倦库蚊成虫，提取其DNA并以此为模板，设计一对引物，采用PCR技术扩增出Cecropins基因，应用相关生物信息学软件分析其序列。结果：克隆出致倦库蚊Cecropins基因，并测定其扩增产物序列，经同源对比确认，进行了相关序列分析。结论：获得致倦库蚊Cecropins基因序列，基因长度为259bp，与尖音库蚊一致性为97%。【关键词】库蚊属；基因cecropin;基因顺序　　［Abstract］Objective:Tocloneandanal

2、yzethesequenceofcecropingeneofCulexquinquefasciatus.Methods:GenomicDNAofC.quinquefasciatusadultswasisolated,andwasusedastemplatetoclonececropingenebyPCRwithapairofdesignedprimersATGAACTTCAACAAGCTTTandCAAGTCCTACTTTCCAAGT.Theobtainedsequencewasanalyzedwithbioinformaticssoftwares.Results:Acec

3、ropingeneofC.quinquefasciatuswasobtained,andwassequencedandanalyzed.Theresultsshowedthatthegenewas259bpandwas97%consistentwiththatofcecropingeneofC.pipiens.Conclusion:Thecloningissuccessful,andoneofthececropingenesofC.quinquefasciatuswasobtained.　　［Keywords］Culex;genececropin;geneorder　　Ce

4、cropins最早是由瑞典科学家Boman等[1]首先从天蚕蛹中发现的，通过向惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)体内注射蜡状芽孢杆菌，可诱导产生抗菌肽(Cecropins)。Cecropins是强碱性蛋白，具有分子量小，水溶性好、不易被酶水解等特点，同时还具有强而广的抗菌、抗癌、抗病毒能力，且对真核细胞无损伤[2]。当前，由于传统抗生素的长期使用，不少病原菌对已有抗生素逐渐产生抗药性，而Cecropins由于其具有特有的抗菌机制和广谱抗菌等特点有可能在医药领域得到广泛应用。致倦库蚊是我国疟疾传播的重要媒介[3]，目前有关致倦库蚊的Cecropins基因研究尚

5、未见报道。2006年克隆了致倦库蚊的Cecropins基因，并对其基因序列及二级结构进行分析。　　1材料与方法　　1.1蚊种及来源　　致倦库蚊（Culex.quinquefascitatus）为贵阳医学院生物学教研室长期繁殖、饲养的贵阳本地株。　　1.2主要试剂5　　TaqDNA聚合酶、PMD18-T载体试剂盒购自大连TaKaRa生物公司，100bpDNALadderMarker来自天为时代，裂解液(25mmol/LNaCl、25mmol/LEDTA、1%SDS、25mol/LpH7.5Tris-HCl)、琼脂糖凝胶回收试剂盒V3.0为道普生物公司产品，蛋白酶K购自Prom

6、ega公司，DP103质粒小提试剂盒购自恒因生物公司。　　1.3实验方法　　1.3.1引物设计　　通过对Genbank中Cecropin基因序列的保守区进行分析,用Primer5.0软件设计出一对特异引物,上游引物P1:ATGAACTTCAACAAGCTTT，下游引物P2:CAAGTCCTACTTTCCAAGT。　　1.3.2DNA提取　　取单只3~5日龄蚊置于1.5ml塑料离心管中，加入裂解液100μl，用玻璃小研棒研磨，直至看不到明显块状物，加入2.5μl蛋白酶K溶液(20g/L),55℃水浴消化1h以上，用等体积的水饱和酚(pH8.0)和氯仿-异戊醇(24∶1)各抽提

7、1次;加入0.2倍体积的乙酸铵溶液(10mol/L)和两倍体积的无水乙醇,-20℃沉淀2h以上,8000r/min离心10min,沉淀用(4℃)预冷的75%乙醇洗涤后离心,沉淀晾干后溶于50μl双蒸灭菌水中,-20℃保存备用。　　1.3.3Cecropins基因PCR扩增　　反应总体积50μl，其中含：10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/LMgCl25μl，0.2mmol/LdNTPs2μl，引物P5和P6（10μmol/L）各1μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，模板DNA量为2μl（单蚊基因组DNA总量的