银杏mect基因启动子克隆及序列分析

《银杏mect基因启动子克隆及序列分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、银杏MECT基因启动子克隆及序列分析袁红慧1，程华１，李琳玲１，陈小玲１，程水源２（１．黄冈师范学院生命科学学院，湖北黄冈４３８０００；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉430023）摘要：以前期获得的银杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）ＭＥＣＴ基因的ｃＤＮＡ序列为模板，通过设计特异性引物及采用染色体步移的方法从银杏基因组中克隆到ＧｂＭＥＣＴ翻译起始位点上游９８２ｂｐ的启动子序列，研究银杏ＭＥＣＴ基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析结果表明，该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件，主要有典型的光

2、响应调节元件、激素响应调控元件、抗病虫害响应元件ＴＧＴＣＡ序列、抗损伤应答元件ＥＲＦ３和热激响应元件ＨＳＥ等。此外，在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件，充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。..关键词：银杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）；染色体步移；２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤藓醇－４－磷酸胱氨酰转移酶基因；调控元件中图分类号：Ｓ７９２．９５文献标识码：Ａ：０４３９－８１１４（２０１５）０７－1746－０5DOI:10.14088/j.ki

3、.issn0439-8114.2015.07.055在银杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）萜内酯合成的ＭＥＰ途径中，ＭＥＣＴ（２－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ４－ｐｈｏｓｐｈａｔｅＣｙｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭＥＰｃｙｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）是其第三步反应的催化酶，催化２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤藓醇－４－磷酸（２－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ－４－ｏｈｏｓｐｈａｔｅ，ＭＥＰ）形成４－（胞苷５－焦磷酸）－２Ｃ－甲基赤藓糖［４－（ｃｙｔｉｄｉｎｅ５－ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ）－

4、２Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ，ＣＤＰ－ＭＥ］，并最终形成合成萜内酯的前体物质，因此ＭＥＣＴ是调控萜类物质合成的一个关键酶。目前，已经从银杏（Ｇｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａ．Ｌ）［１］、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）［２］、玉米（Ｚｅａｍａｙｓ）［３］、番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）［４］、水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）［５］、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）［６］、火炬松（Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａ）［７］等多种植物中克隆了ＭＥＣＴ基因。研究发现，在ＤＮＡ水平上，银杏Ｍ

5、ＥＣＴ基因与拟南芥和水稻ＭＥＣＴ基因相似度分别达到了７０．７％和７０．２％。尽管已从多种植物中获得ＭＥＣＴ基因的ｃＤＮＡ序列，但目前关于该基因启动子表达调控方面的研究报道较少，尤其缺乏对该基因启动子的基本结构和功能分析方面的探究，本试验通过染色体步移法克隆银杏ＭＥＣＴ基因的启动子，初步分析该启动子所含的调节元件和作用特点，旨在为启动子下一步的功能分析提供可靠依据。１材料与方法１．１试验材料银杏幼叶采自黄冈师范学院银杏苗圃园，品种为家佛手１４年生实生苗。采后自封袋封装，于－８０℃冰箱中冷冻保存。试验所用大肠杆菌

6、（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）菌株Ｔｏｐ１０为经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室保存。１．２试验试剂各种限制性内切酶、ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ产物克隆载体ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ、ｄＮＴＰ、ＤＬ２０００、Ｔ４ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ和Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ均购自大连宝生物工程有限公司；ＤＮＡ回收试剂盒为Ａｘｙｇｅｎ公司产品。各种寡核苷酸序列由上海生物工程有限公司合成。１．３试验方法１．３．１银杏ＤＮＡ提取采用改良的ＣＴＡＢ法［８］大量提取银杏基因组ＤＮＡ。１．３．２基因组酶切与连接用

7、平末端限制酶ＥｃｏＲⅤ、ＤｒａⅠ、ＳｓｐⅠ、ＰｖｕⅡ、ＳｔｕⅠ、ＨｐａⅠ、ＳｃａⅠ和ＳｍａⅠ分别进行单酶切，３７℃酶切过夜（８ｈ），各取５μＬ用０．８％的琼脂糖电泳检测是否酶切完全，酶切产物分别纯化回收；回收后与各自的接头连接，体积为５０μＬ。连接反应体系为ＤＮＡ酶切产物（模板）３０μＬ、Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅＢｕｆｆｅｒ（１０×）５μＬ、接连体１０μＬ、Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ３μＬ、ｄｄＨ２Ｏ２μＬ，反应程序为１６℃连接１２ｈ。１．３．３引物设计及染色体步移扩增根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ提交的银杏ＭＥＣＴ基因ｃＤ

8、ＮＡ序列（登录号ＤＱ１０２３６０）分别设计引物ＭＴ１、ＭＴ２（表１），与２个接头引物ＡＰ１、ＡＰ２形成巢式引物，进行第一次步移扩增。将得到的目的片段连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，送出测序。根据第一次扩增的启动子序列，继续设计引物ＭＴ３、ＭＴ４（表１）进行了第二次步移并测序。１．３．４目的片段回收、片段与载体连接、转化及测序根据琼脂糖电泳检测扩增结果，采用胶回收试剂盒回收所需的目的片段。所用的Ｔ载体为ｐ