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《柑桔黄龙病病原dna片段的克隆及序列分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、第30卷 第1期植 物 病 理 学 报Vol.30No.12000年 2 月ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICAFeb.2000文章编号:041220914(2000)0120071205柑桔黄龙病病原DNA片段的克隆及序列分析孔维文,邓晓玲,梁志慧,唐伟文(华南农业大学植物病理教研室,广州510642)摘要:本研究利用聚合酶链式反应技术(PCR),合成了中国柑桔黄龙病病原的一段DNA片段。将此片段插入到pUC18的EcoRI位点,并转化进大肠杆菌(Escherichiacoli)的DH5A菌株中。通过PCR鉴定,限制性内切酶(EcoRI)酶切分析及核苷酸序列分析,均表明克
2、隆成功。序列分析结果显示,克隆片段与已知相应序列间同源性达98.6%。该研究为制备柑桔黄龙病病原DNA分子探针奠定了基础。关键词:柑桔黄龙病;聚合酶链式反应;克隆;序列分析中图分类号:S436.661.12 文献标识码:ACLONINGANDSEQUENCINGOFTHECITRUSHUANGLONGBINGPATHOGENDNAKONGWei2wen,DENGXiao2ling,LIANGZhi2hui,TANGWei2wen(SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract:ADNAfragmentofci
3、trusyellowshootpathogeninChinawasobtainedbypolymerasechainreaction(PCR)andinsertedintotheEcoRIsiteofplasmidpUC18,whichwasla2tertransformedintoDH5AstrainofEscherichiacoli.TheclonedDNAfragmentwasverifiedbyPCR,restrictionendonuclease(EcoRI)digestionandsequencinganalyses.Theresultsofsequencinganalysis
4、showedthattheclonedDNAshared98.6%homologywithapublishedDNAnucleotidesequence.Keywords:CitrusHuanglongbing;polymerasechainreaction(PCR);cloning;sequentialanalysis 柑桔黄龙病(citrusyellowshoot)是柑桔栽培上的毁灭性病害,严重地限制了柑桔生产。该[1]病害目前被认为是由原核生物薄壁菌门韧皮部杆菌属(Liberobacter)引起的。根据病原物对热的敏感性、不同虫媒和地理分布,可分为亚洲株系(L.asiaticum)
5、及非洲株系(L.africanum)2[2、3][4]类。我国的柑桔黄龙病病原属于亚洲株系。近年来,随着我国柑桔良种苗木繁育体系的初步形成,生产上迫切要求有一套准确、灵敏及快速的病原检测方法,以适应对苗木的无毒鉴定及病[5]害防治的需要。由于柑桔黄龙病症状复杂,易与一些生理性病害混淆,且植株感病后潜育期长,收稿日期:1998209221;修回日期:1999207214 基金项目:国家自然科学基金(39700096);广东省自然科学基金资助项目(960431)作者简介:孔维文(19722),男,广东人,现在南京农业大学植物病理专业攻读博士学位;邓晓玲(19662),女(哈尼族),云南人,副
6、教授,硕士,主要从事植物病理学研究,为本文的联系作者。72植 物 病 理 学 报30卷这就给黄龙病的正确诊断带来很大的困难。聚合酶链式反应技术(polymerasechainreaction,[4,6]PCR)被证明是一种可快速、灵敏地检测出柑桔黄龙病病原的方法。但要制备检测柑桔黄龙病的PCR检测试剂盒,在生产上推广应用,首先要克隆一个病原DNA的片段。另外,若能将病原DNA的片段进行克隆,并用地高辛标记制备成探针,也可通过分子杂交手段在生产上大量检测柑桔黄龙病病原。本文报道了柑桔黄龙病病原DNA部分片段的克隆和序列分析结果。1 材料与方法1.1 材料感病长春花(Catharan
7、thusroseas):盆栽于防虫网室内,柑桔黄龙病病原是由草地菟丝子(CuscutacampestrisL.)从病柑桔传递到长春花上,表现出典型的柑桔黄龙病斑驳症状,再经顶芽嫁接而获得的。PCR相关试剂:购自华美生物工程公司。PCR产物纯化试剂盒(PCRCleanUpKit):购自BoehringerMannheim公司。EcoRI、去磷酸化酶、T4DNA连接酶(Ligase):均为Promega公司产品。1.2 方法
