柑橘黄龙病病原菌序列克隆及系统进化发育的研究

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1、广西大学博士学位论文柑橘黄龙病病原菌序列的克隆及系统进化发育研究姓名：廖惠红申请学位级别：博士专业：作物栽培学与耕作学指导教师：李杨瑞20090601柑橘黄龙病病原菌序列的克隆及系统进化发育研究摘要黄龙病是柑橘上的一种毁灭性病害，其病原为革兰氏阴性细菌，寄生在韧皮部筛管细胞内。目前发现有3个种和黄龙病有关，分别是亚洲种、非洲种和美洲种。柑橘黄龙病病原菌因无法在培养基上培养，基因组序列信息非常有限。本研究利用基因组步行的方法从亚洲种rplKAJL—rpoBC，16S／23SrRNA，omp基因3个位点上扩增黄龙病亚洲种的核苷酸序列，并根

2、据亚洲种16S．23SrRNA位点上新序列的保守性设计引物在非洲种和美洲种上扩增，最后根据3个种在同一位点上序列的保守性设计引物分别对不同地理来源的黄龙病样品进行测序分析，旨在探讨其系统进化发育关系，从而为以PCR为基础的黄龙病相关研究提供理论基础。本研究所获主要结果如下：l、在亚洲种3个位点上共获得了15，168bp非冗余新序列，其中，在rplKAJL．rpoBC位点上5’端上游区和3’端下游区分别获得了3，218bp和2,653bp的非冗余新序列；在16S／23SrRNA位点上5’端上游区和3’端下游区分别延伸了1，853bp和2

3、，459bp的新序列；在omp基因位点上分别获得了4,014bp和971bp的新序列。序列分析表明在rplKAJL．rpoBC位点上的新序列包含2个新基因(suhB和serA)；16S／23SrRNA位点新序列包含4个新基因(膜转运蛋白基因、细胞壁脱氢酶假基因、5SrRNA、tRNAM豇)，omp位点新序列包含6个新基因(rpsB、tsf,pyrH、∥、cdsA2、cds2)。2、在非洲种16S／23SrRNA位点上，获得了3,057bp序列包括23SrRNA基因、细胞壁脱氢酶假基因和5SrRNA基因，它们的全长分别是2,205bp、

4、559bp和119bp。23SrRNA基因和5SrRNA基因区间是645bp。3、在美洲种16S／23SrRNA位点上，获得了3,033bp序列包括23SrRNA基因、glpK基因和5SrRNA基因，它们的全长分别是2，194bp、459bp和12】bp。23SrRNA基因和5SrRNA基因区间是650bp，反向编码甘油激酶的细胞壁脱氢酶基因gtpK正好位于此区间内。相对于亚洲种，美洲种5SrRNA基因之后有20bp碱基的缺失。4、从16SrRNA基因到5SrRNA基因，亚洲种、非洲种和美洲种序列长度分别为5,043bp、5,037b

5、p和5,006bp。这些序列用于同源性分析，结果显示：亚洲种和非洲种之间的同源性(95．2％)较亚、洲种和美洲种的同源性(92．9％)高，非洲种和美洲种之间的同源性(92．6％)与亚洲种和美洲种的同源性较接近(92．9％)。5、3个病原菌16S／23SrRNA位点上的基因顺序分别是亚洲种为16SrRNA、tRNAlk、tRNAAh、23SrRNA、细胞壁脱氢酶假基因、5SrRNA和tRNAMn：非洲种为16SrRNA、tRNAII。、tRNA地、23SrRNA、细胞壁脱氢酶假基因和5SrRNA；美洲种为16SrRNA、tRNA¨。、t

6、RNA～8、23SrRNA、gtpi基因和5SrRNA。6、不同地理来源的黄龙病样品序列同源性分析结果显示：来源于巴西圣保罗的样品与美洲种同源性为99．8％．100％，来源于非洲地区的样品与非洲种同源性为99．9．100％，来源于中国广西、福建、湖南、台湾和美国佛罗里达州的样品与亚洲种同源性为99．8％．100％。7、基于23S．5S位点序列构建的系统发育树显示来源于巴西圣保罗的样品与美洲种聚为～类，来源于非洲地区的样品与非洲种聚为一类，来源于中国广西、福建、湖南、台湾和美国佛罗里达州的样品与亚洲种聚为一类。该结果与不同地理来源的黄龙

7、病样品序列同源性分析结果一致，说明来源于巴西圣保罗的样品属于美洲种类型，来源于非洲地区的样品属于非洲种类型，来源于中国广西、福建、湖南、台湾和美国佛罗里达州的样品属于亚洲种类型。在这些样品中，相对于不同的种，同一种类型即种内之间的同源性非常高，为99．8％．100％之间；相对于同一种，不同种类之间同源性较低，亚洲种和非洲种之间的同源性为97．3％．97．5％，亚洲种和美洲种之间的同源性为94．1％．94．4％，非洲种和美洲种之间的同源性为94．O．94．2％。关键词：柑橘；黄龙病；病原；序列IISequencesCloningandP

8、hylogeneticAnalysisof“CandidatusLiberibacter’’，BacteriumAssociatedwithHuanglongbingLiaoHuihong(AgriculturalCol