幽门螺杆菌caga基因克隆、表达、免疫原性测定及其对胃上皮细胞凋亡影响

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1、硕士学位论文中文摘要摘要第一章幽门螺杆菌cagA基因的克隆、原核表达及免疫活性研究目的：克隆胃癌特异性幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H．pylori)的cagA基因片段，建立原核表达系统，鉴定重组表达产物的免疫原性。为临床胃癌相关H．pylori菌株筛选和针对性治疗奠定基础。方法：选取前期研究确定的可能与胃癌相关的第6型菌株cagA基因片段，在6enBank中确定为AAG09884，优化设计并合成cagh基因。并在该基因两端分别添加内切酶位点，将合成的cagA基因从puc57-Cagh

2、质粒中切出，用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3)，通过氨卞青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-cagA。以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白，经SDS—PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况，用Western—blot鉴定融合蛋白的抗原性。结果：1．靶基因合成：设计并人工合成了cagA基因片段(从G09884)，该基因长度为678bp，编码228个氨基酸(图I-1)。序列测定结果显示，合成的cagA基因序列与设计的序列完全一致。2．成功构建

3、pET32a-CagA原核表达质粒，其目的cagA基因的测序结果与设计的序列同源性为100％，对应蛋白序列同源性100％。3．含pET32a-cagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达出CagA融合蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明，融合蛋白分子量大小与预期相一致(45KD)。4．Western-blot检测结果显示该融合蛋白可与抗n．pylori全菌抗体结合反应。结论：1．成功合成H．pylori菌株cagA基因片段，经测序分析其氨基酸序列与GenBank上AAG09884的同源

4、性达100％。2．成功构建原核表达质粒pET32a-cagA，经IPGT诱导转化宿主菌，获得分子量约45KD的CagA融合蛋白，且此蛋白具有CagA蛋白的抗原性。关键词：幽门螺杆菌，cagA基因，克隆，。原核表达，免疫原性硕士学位论文中文摘要第二章幽门螺杆菌oagA基因在胃上皮细胞中的表达及其对细胞凋亡的影响目的：构建含cagA基因的真核表达载体，并在胃上皮细胞GES-1中表达，观察其表达和定位情况及其对细胞凋亡的影响。方法：将合成的cagA基因片段从puc57-cagA质粒中切出，分别克隆至绿色荧光蛋白

5、表达载体pEGFP-C1及表达载体pCDNA3．1-his／myc-A，用脂质体法分别将重组表达载体转染入胃上皮细胞GES-1中，用荧光显微镜观察其在GES-1细胞中的表达及定位，用荧光实时定量PCR及Western-blot检测cagA基因在细胞中的表达情况。用流式细胞仪观察CagA蛋白对细胞凋亡的影响。结果：1．成功构建pEGFP-CI-cagA和pCDNA3．卜his／myc—A—cagA真核表达质粒，目的基因的测序结果与设计的序列完全一致。2．绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C卜cagA转染GES

6、-1后，其表达分布于细胞质和细胞核中。3．表达质粒pCDNA3．卜his／myc—A—cagA转染GES-1细胞后，cagA基因在细胞中获得了表达。4．转染pCDNA3．1．his／myc—A—cagA的GES-1细胞行流式细胞仪分析示CagA蛋白有促进细胞凋亡的作用。结论：1．成功构建幽门螺杆菌cagA基因的真核表达质粒，并在胃上皮细胞株GES-1中获得了表达，且在细胞质和细胞核内均有表达。2．经流式细胞仪分析，CagA蛋白具有促进胃上皮细胞株GES-1凋亡的作用。关键词：幽门螺杆菌，cagA基因，表达

7、，细胞凋亡ⅡABSTRACTPart1Thestudyofclone，nucleusresponseandimmunogenicityofthecagAgeneofHelicobacterpyloriobjective：ThisstudyisaimedtoclonethespecificcagAgenesegmentofthegastriccanceridiotypeHelicobacterpylori(H．pylori)。establishthesystemofprokaryoticexpression

8、andidentifytheImmunogemcRyofsequencesofrecombinationsignal．AnditalsohopedtosetthefoundationforpickingoutthestraininH．pyloricorrelatedtogastriccanceranddirectiontherapyinclinical．Methods：SelectthesixthtypecagAfragmen