幽门螺杆菌caga基因在果蝇特定组织表达引起的表型变化与其对特定wnt信号通路成员表达的影响

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1、·中文论著摘要·幽门螺杆菌cagA基因在果蝇特定组织表达引起的表型变化及其对特定Wnt信号通路成员表达的影响刖声胃癌是世界上第四大恶性肿瘤，同时它也是第二位导致死亡的肿瘤，每年有超过70万人死于胃癌。流行病学研究提示幽门螺杆菌在胃癌发生中起重要作用。幽门螺杆菌是革兰氏阴性菌，螺旋状。1984年被Warren和Marshall从人胃黏膜中分离并培养。按照是否存在细胞毒素相关基因A(cagA)，幽门螺杆菌可分为cagA阳性株和cagA阴性株。CagA蛋白通过IV型分泌系统被注入细胞内。移位后的CagA定植于浆膜的内侧面，并在此被Src激酶或Abl激酶酪氨酸磷酸化。CagA酪氨酸磷酸化

2、的位点存在谷氨酸．脯氨酸．异亮氨酸．酪氨酸．丙氨酸(EPIYA)序列，该序列在CagA蛋白C末端重复出现。应用CagA转基因小鼠证实CagA是作用于哺乳动物的细菌来源的癌蛋白，并且CagA酪氨酸磷酸化在幽门螺杆菌相关的肿瘤发生起重要作用。近来还有研究表明CagA可通过磷酸化非依赖方式使13-catenin从细胞膜上移位到胞浆／胞核中，从而活化13-catenin信号。13-catenin既是粘附连接的重要组成，同时也是Wm信号通路的关键分子。而Wnt信号通路是在不同种属间高度保守，在发育和肿瘤发生中都起着重要作用。Wnt信号通路成员APC或Axin基因的突变可导致结直肠癌，胰腺癌

3、和肝细胞癌的发生。但Wnt信号通路与胃癌的发生是否相关尚不清楚，而CagA作为胃癌发生的重要因素之一，是否会影响到Wnt信号通路的活化也有待研究。为此，本研究利用cagA转基因果蝇，研究其通过GAL4．UAS系统在果蝇复眼与翅膀表达时表型变化情况，并且进一步研究了CagA对Wnt信号通路中Wingless、Armadillo(13-catenin的果蝇同系物)和APC表达的影响情况。实验方法一、pUAST-cagA—HA质粒的构建从pSP65SRa-cagA．HA质粒@PCR扩增得至lJcagA—HA片段(两端加有BamHI和XhoI酶切位点)，经BamHI和XhoI酶切后构建-

4、于pUSAT载体上。构建后的质粒在大肠杆菌DH5a中克隆扩增后经EcoRI单酶切及BamHI／XhoI双酶切检测是否构建成功，通过测序检测其基因序列是否正确。二、eagA转基因的果蝇的制备过程在苹果培养基平板上收集在30分钟内yw果蝇所产的卵，浸于NaCl0溶液中脱壳处理后，蒸馏水洗净，将卵头尾一致整齐排列，放入硅胶盒中干燥5．10分钟，矿物油覆盖。在倒置显微镜下从卵尾侧注射制备好的质粒。由于个人技术原因，经过3个月的制备未成功获得转基因果蝇，美国奥勒冈大学分子生物学学院KarenGuilemin教授赠送cagA转基因果蝇(yw；；UAS．HA—cagA)。本文实验所用cagA转

5、基因果蝇皆为此品系果蝇。三、复眼及翅膀中表达CagA果蝇的制备将UAS．HA．cagA转基因果蝇品系与眼原细胞特异表达的GMR．GAL4及在翅膀中特异表达的MSl096．GAL4品系果蝇杂交，诱导cagA在果蝇复眼与翅膀中表达，同时将yw果蝇品系与GMR．GAL4及MSl096．GAL4品系果蝇杂交做为对照。将以上果蝇放置250C恒温培养约10天后产生F1代，在体视显微镜下观察子代Fl代的复眼与翅膀表型，UAS．HA．cagA转基因果蝇与GMR．GAL4交配果蝇所得F1代进行自交配，观察其F2代果蝇表型情况。四、表达CagA蛋白果蝇的胚胎的制备及应用免疫荧光染色方法检测wingl

6、ess、APC及Armadillo的表达收取Arm．GAL4(AnIl启动子在胚胎广泛表达)与UAS．HA．cagA交配果蝇的F1代雄性果蝇与UAS．HA．cagA处女果蝇交配，将所得果蝇卵蒸馏水冲洗，NaCIO去除卵壳处理后，庚烷．甲醛混合液固定30分钟，经甲醇处理后，加一抗(兔抗EAPC，小鼠抗Armdillo，大鼠抗HA，小鼠抗Wingless)，40C摇床孵育过夜(12．14h)。而后BBT溶液清洗，加入二抗Alexagoat488anti．rabbit，546anti-mouse，647anti．rat，室温孵育2h。BBT溶液清洗。荧光封片剂封片，激光扫描共聚焦显微镜

7、下观察并进行图像采集。2实验结果1、pUAST-cagA—HA质粒构建成功酶切结果表明质粒构建成功。利用测序引物进行测序，测序结果在NCBI网站上进行Blot，结果与幽门螺杆菌NCTC11637株cagA(AF202973)基因完全吻合。2、CagA在果蝇复眼与翅膀表达诱导产生的表型变化GMR．GAL4果蝇与UAS-HA-cagA果蝇交配，F1代果蝇均出现轻度糙眼突变。F2代出现重度糙眼突变果蝇。MSl096-GAL4果蝇与UAS—HA—cagA果蝇交配。F1代出现弯翅突变。3、