DAPT对肺成纤维细胞表型转化中Wnt信号通路影响研究

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1、摘要目的：研究Y．分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路后，Wnt信号通路中的wntl、p-catenin及肌成纤维细胞标志因子c【-SMA的表达变化，探讨Wnt／13一catenin信号通路与Notch信号通路之间存在直接或间接的相互作用以及Wnt／p-catenin信号通路在DAPT抑制肺成纤维细胞表型转化中的作用表达。方法：(1)从出生2．3天SD大鼠的幼鼠中取得肺组织，采用胰酶消化法分离培养出肺成纤维细胞，并使用波形蛋白(Vimentin)免疫细胞化学方法检测培养至第三代肺成纤维细胞的纯度；(2)予无血清的DMEM培养基同步培养细胞24h，并将其分为对照组、TGF．131组、T

2、GF．DI+DAPT组；(3)分别在TGF．131组和TGF．pI+DAPT组中加入5ng／mlTGF．p1诱导成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，并在TGF．[31+DAPT组中加入500nmol／L的DAPT抑制纤维细胞增殖，并作用于肺成纤维细胞24h，观察其形态学改变；(4)分别采用RT-PCR法检测Ct．SMA、wntl及[3-catenin的mRNA表达变化，Westernblot法检测[3-catenin的蛋白表达变化；(5)采用SPASSl3．0统计软件进行统计学分析，两样本均数间比较采用t检验，多样本间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD．t检验。结果：(1)Vim

3、entin免疫细胞化学检测：几乎所有第三代细胞胞质内均可见棕黄色颗粒，证明使用胰酶消化至第三代细胞几乎全为肺成纤维细胞；(2)a．SMAmRNA表达：对照组0【．SMAmRNA值(0．385±O．015)、TGF．D1组(O．615+0．025)、TGF．pI+DAPT组(O．345±0．027)，其中TGF．131组仅．SMAmRNA值较对照组和TGF．[31+DAPT组明显升高，差异有统计学意义(pD∞)；(3)wntlmRNA值表达：对照组wntlmRNA值(0．233士0．005)、TGF．p1组(O

4、．257+0．010)、TGF．pI+DAPT组(0．209+0．016)，可知TGF．p1组wntlmRNA值较对照组和TGF．摘要B1+DAPT组显著升高，差异有统计学意义(p

5、)TGF—B1可诱导肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，在转化过程中0【．SMA、lB-catenin、wntl表达增高；(2)DAPT阻断Notch信号通路后，影响了成纤维细胞表型转化中Wnt／lB．catenin信号通路，下调0【．SMA、13-catenin、wntl的mRNA及蛋白表达；(3)Wnt／13．catenin信号通路与Notch信号通路之间可能存在相互关系。关键词：TGF．131；wnt／13．catenin信号通路；wntl；DAPT；抑制；增殖ABSTRACTobjective：Tostudytheexpressionvariabilityofwnt1，beta-cat

6、eninandmyofibroblastcellmarkerfactornamedalpha-SMAinWntsignalpathway’Saftergamma-secretaseinhibitorofDAPTblocksNotchsignalingpathway．ToexploretheindirectordirectinteractionsbetweenthesignalingpathwaysofWnt／beta-cateninandNotch，andtostudytheexpressionofWnt／beta-cateninsignalingpathwayofDAPT’inhibit

7、ionoflungfibroblastcellphenotypictransdifferentiation．Methods：(1)TogetthelungtissuefromSDratsof2or3-day-old．IsolatingandC12lturinglungfibroblastbymeanofthemethodoftrypsindigestion，WithVimentinimmunocytochemistry,