睾酮对心肌成纤维细胞表型转化的干预研究

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1、睾酮对心肌成纤维细胞表型转化的干预研究：刘新强吴赛珠邢晓雯阮云军何天民罗才福赖文岩【摘要】目的观察氧化应激对心肌成纤维细胞(CF)表型转化的影响以及睾酮的干预作用，初步探讨睾酮抗心脏老化过程中心肌纤维化的机制。方法差速贴壁法培养雄性昆明白乳鼠心肌成纤维细胞，用β半乳糖苷酶瓤色检测细胞的衰老，MTT法检测细胞增殖能力，采用免疫细胞化学染色检测肌成纤维细胞的典型标记α平滑肌肌动蛋白（αSMA）。结果H2O2刺激下β半乳糖苷酶染色阳性细胞比例增加，心肌成纤维细胞增殖率降低，αSMA免疫化学染色

2、出现明显强阳性；睾酮在3.0×10-9、3.0×10-8和3.0×10-7mol/L3种浓度下均具有延缓H2O2诱导的以上效应，氟他胺（Flu）能部分阻断睾酮的各种保护作用。结论睾酮通过受体机制可以逆转H2O2诱导的心脏成纤维细胞表型的转化，这可能是睾酮抗心脏老化过程中心肌纤维化的机制之一。【关键词】睾酮;氧化应激；衰老;心肌成纤维细胞;表型【Abstract】ObjectiveToobservetheinterventioneffectoftestosteroneonphenotypeofcard

3、iacfibroblastsinducedbyoxidativestress.MethodsCardiacfibroblastfromventricleofheartofneonatalmaleKunmingmiceethod.TheexpressionofSAβgalineachgroupethod.Proteinlevelofαsmoothmuscleactin(αSMA)arkofmyofibroblasteasuredbyimmunostaining.Resultsparedtoco

4、ntrolgroup,H2O2causedmorecellularsenescenceanddepressedtheproliferationofcells,andtheexpressionofαSMAulated.Undertheseconcentrations(3×10-9,3×10-8and3×10-7mol/L),testosteronepretreatmentofcellssignificantlyattenuatedalltheseeffectsofH2O2exposure.Fluta

5、mideadministeredpriortotestosterone(3×10-8mol/L)pretreatmentandpartlyantagonizedtheprotectiveeffectsoftestosteroneagainstH2O2exposure.ConclusionsThereversingeffectsoftestosteroneonthephenotypeconversionofcardiacfibroblastsmediatedbytheandrogenreceptors

6、mightbeoneofthemechanismsforfightingagainstcardiacfibrosisduringagingprocessofheart.【Keya公司产品,其他试剂均为国产分析纯或进口分装。1.3细胞培养与分组心肌成纤维细胞的原代培养采用差速贴壁法进行。无菌条件下，取出生后1d昆明白小鼠左心室心肌,4℃生理盐水冲洗,剪下心室组织放于DHanks液中剪碎,0.25%胰酶0.01%胶原酶Ⅱ消化,每10～15min收集1次细胞悬液,共6～7次,离心,DHanks液洗涤

7、1次,将所得的全部细胞置于含有20%小牛血清的DMEM培养基的大培养瓶中,5%CO2孵箱贴壁培养20～30min后,再贴壁1次,弃细胞悬液后,留在瓶底的细胞主要为成纤维细胞,待细胞长满瓶底后,用0.25%胰酶消化传代,以保证细胞的数量和纯度。取第2～3代细胞进行实验。细胞贴壁达到80%后进行实验及分组:①正常对照组:予低血清(2%)培养基;②H2O2刺激组:予低血清(2%)培养基+H2O2(80μmol/L);③各浓度睾酮干预组:分别予睾酮3.0×10-9、3.0×10-8、3.0×10-7和3.0

8、×10-6mol/L培养30min后,再予H2O2(80μmol/L);④机制研究组:予雄激素受体阻滞剂氟他胺(Flu)1×10-6mol/L培养30min后,给予睾酮(3.0×10-8mol/L)，30min后再予H2O2(80μmol/L)。1.4四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测细胞增殖细胞（1×104/孔）接种于96孔培养板中，每孔加100μl培养液，置于5%CO2培养箱中过夜。弃去培养液后按照实验分组（每组5孔）置培养箱培养72h，终止培养前每孔