睾酮对心肌成纤维细胞表型转化的干预研究论文

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1、睾酮对心肌成纤维细胞表型转化的干预研究论文刘新强吴赛珠邢晓雯阮云军何天民罗才福赖文岩【摘要】目的观察氧化应激对心肌成纤维细胞(CF)表型转化的影响以及睾酮的干预作用，初步探讨睾酮抗心脏老化过程中心肌纤维化的机制。方法差速贴壁法培养雄性昆明白乳鼠心肌成纤维细胞，用β半乳糖苷酶瓤色检测细胞的衰老，MTT法检测细胞增殖能力，采用免疫细胞化学染色检测肌成纤维细胞的典型标记α平滑肌肌动蛋白（αSMA）。结果H2O2刺激下β半乳糖苷酶染色阳性细胞比例增加，心肌成纤维细胞增殖率降低，αSMA免疫化学染色出现明显强阳性；睾酮在3

2、.0×10-9、3.0×10-8和3.0×10-7mol/L3种浓度下均具有延缓H2O2诱导的以上效应，氟他胺（Flu）能部分阻断睾酮的各种保护作用。结论睾酮通过受体机制可以逆转H2O2诱导的心脏成纤维细胞表型的转化.freelventricleofheartofneonatalmaleKunmingmiceethod.TheexpressionofSAβgalineachgroupethod.Proteinlevelofαsmoothmuscleactin(αSMA)arkofmyofibroblasteasure

3、dbyimmunostaining.Resultsparedtocontrolgroup,H2O2causedmorecellularsenescenceanddepressedtheproliferationofcells,andtheexpressionofαSMAulated.Undertheseconcentrations(3×10-9,3×10-8and3×10-7mol/L),testosteronepretreatmentofcellssignificantlyattenuatedalltheseeffect

4、sofH2O2exposure.Flutamideadministeredpriortotestosterone(3×10-8mol/L)pretreatmentandpartlyantagonizedtheprotectiveeffectsoftestosteroneagainstH2O2exposure.ConclusionsThereversingeffectsoftestosteroneonthephenotypeconversionofcardiacfibroblastsmediatedbytheandrogenr

5、eceptorsmightbeoneofthemechanismsforfightingagainstcardiacfibrosisduringagingprocessofheart.【Keya公司产品,其他试剂均为国产分析纯或进口分装。1.3细胞培养与分组心肌成纤维细胞的原代培养采用差速贴壁法进行。无菌条件下，取出生后1d昆明白小鼠左心室心肌,4℃生理盐水冲洗,.freelin收集1次细胞悬液,共6～7次,离心,DHanks液洗涤1次,将所得的全部细胞置于含有20%小牛血清的DMEM培养基的大培养瓶中,5%CO2孵箱贴壁

6、培养20～30min后,再贴壁1次,弃细胞悬液后,留在瓶底的细胞主要为成纤维细胞,待细胞长满瓶底后,用0.25%胰酶消化传代,以保证细胞的数量和纯度。取第2～3代细胞进行实验。细胞贴壁达到80%后进行实验及分组:①正常对照组:予低血清(2%)培养基;②H2O2刺激组:予低血清(2%)培养基+H2O2(80μmol/L);③各浓度睾酮干预组:分别予睾酮3.0×10-9、3.0×10-8、3.0×10-7和3.0×10-6mol/L培养30min后,再予H2O2(80μmol/L);④机制研究组:予雄激素受体阻滞剂氟他胺(Flu

7、)1×10-6mol/L培养30min后,给予睾酮(3.0×10-8mol/L)，30min后再予H2O2(80μmol/L)。1.4四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测细胞增殖细胞（1×104/孔）接种于96孔培养板中，每孔加100μl培养液，置于5%CO2培养箱中过夜。弃去培养液后按照实验分组（每组5孔）置培养箱培养72h，终止培养前每孔加入MTT20μl（最终浓度为1mg/ml），37℃培养4h。弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，微振荡，用酶标仪在492nm下测定各孔光吸收值。以实验组与对

8、照组的光吸收值平均值百分比代表细胞增殖的百分数，实验重复4次。1.5SAβ半乳糖苷酶(SAβgal)染色(1)吸除细胞培养液,用PBS漂洗2次后,用4%多聚甲醛和0.2%戊二醛4℃固定10min。(2)吸净固定液,用PBS洗涤细胞3次,每次3min,吸净PBS,在新鲜配置的Xga