rhbmp┐2对成纤维细胞成骨表型的影响论文

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1、rhBMP┐2对成纤维细胞成骨表型的影响论文.freelL-1和1200μgmL-1作用最强.rhBMP-2对细胞增殖规律无明显影响.结论rhBMP-2可促进成纤维细胞成骨表型表达.Keyorphogeicprotein;pheno-typeAbstract:AIMToinvestigatetheeffectofrhBMP-2onos-teogenicphenotypeoffibroblastanddiscusstheconditionthatfacilitatesosteogenesisoffibroblasts.METHODSrhBMP-2indifferentcon

2、centrationulatedtheex-pressionofosteocalcin.P-2hadnoeffectonproliferationoffibroblasts.CONCLUSIONrhBMP-2couldstimulatetheexpressionofosteogenicphenotypeoffibroblastsinvitro.0引言组织工程学由三个要素组成，即:种子细胞、调节细胞生长与增殖的细胞因子和支持细胞生长的细胞外基质.在骨组织工程学的研究中，种子细胞来源可有较多选择，而成纤维细胞因在体内存在范围广泛、取材方便、容易培养而得到研究者的重视.但在何种

3、条件下成纤维细胞可向成骨细胞方向转化，目前研究不多.本研究旨在探索在rhBMP-2作用下成纤维细胞成骨表型的变化.1材料和方法1.1材料DMEM、小牛血清、牛胰蛋白酶（华美公司）;rhBMP-2（本校生物化学教研室提供）;碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（广东佳标生物制品公司）;骨钙素放射免疫检测试剂盒（北京东亚免疫技术研究所）;Heraus细胞培养箱（德国）;Hitach2006型紫外分光光度计（日本）;γ-射线检测仪（美国CapintecInc）.NIH3T3细胞由本校口腔医学院口腔生物教研室提供，DMEM/200mLL-1小牛血清（DMEM/200mLL-1BS），5

4、0mLL-1CO2，37℃培养，2.5gL-1牛胰蛋白酶消化传代，按2×103/孔传代至96孔培养板内，同一条件下培养.1.2方法1.2.1rhBMP-2对成纤维细胞的作用将rhBMP-2溶解于DMEM中，针头滤器过滤除菌，质量浓度为10gL-1;细胞传代24h后，向每个培养孔内添加rhBMP-2，并使其终质量浓度分别为0，100，200，400，800，1200和1600mgL-1，分别在培养3和6d停止培养，检测碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙素表达.各组培养的细胞在培养过程中每日计数细胞的数量，并绘制细胞生长曲线.培养的细胞同时行光镜观察.1.2.2ALP活力的检测将

5、培养至3和6d的细胞培养孔内培养基吸除，并用0.01molL-1PBS洗涤3次，0.1gL-1TritonX-100处理细胞过夜（50μL/孔），然后向培养孔内加入ALP缓冲液100μL/孔，37℃保温25min，加入显色剂100μL/孔，37℃处理5min，紫外分光光度计上检测其吸光度，并绘制直方图.培养的细胞同时行钙-钴法ALP染色.1.2.3骨钙素表达的检测按照试剂盒操作说明操作，将γ-计数仪测量结果绘制标准曲线.2结果2.1成纤维细胞形态学正常成纤维细胞（NIH3T3）为长梭型，细胞突起较少，细胞内颗粒也较少.在rhBMP-2作用下，细胞形态发生明显变化，表现为细

6、胞突起增多，胞体增宽、增大，细胞内颗粒状物质增多.钙-钴法染色显示细胞内的颗粒为碱性磷酸酶颗粒.亦即说明在rhBMP-2作用下，细胞内ALP颗粒增多.2.2成纤维细胞ALP活性正常成纤维细胞内有一定水平ALP的表达.在rhBMP-2作用下，细胞ALP活力明显增高，随着rhBMP-2质量浓度的增加，ALP活力逐渐增强;当rhBMP-2质量浓度为1200gL-1时对ALP活力促进作用最大.随着时间的延长，成纤维细胞ALP活性有所增加（Fig1），考虑到细胞数量的增加，所以rhBMP-2对ALP的促进作用可能并不一定随着时间的延长而增强.在细胞培养3d更换培养液时如不再加入rh

7、BMP-2，结果发现，6d时其ALP活性较同组加入了rhBMP-2的细胞的ALP活性为低.以上证明，成纤维细胞ALP活性的变化是在外源rhBMP-2影响下出现的细胞表型的变化.2.3成纤维细胞的增殖每个培养孔内加入细胞量为2×103/孔，DMEM/200mLL-1BS，50mLL-1CO2，37℃培养条件下，正常成纤维的增殖周期为6d;在使用rhBMP-2的每个组中，细胞的增殖周期没有明显的变化，细胞生长过程中的计数无明显的差别，说明rhBMP-2对成纤维细胞的增殖无明显影响.2.4成纤维细胞骨钙素的表达正常成纤维细胞内有一定