维甲酸对成纤维细胞及脂肪源干细胞成骨诱导的影响

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1、南方医科大学2013级硕士学位论文维甲酸对成纤维细胞及脂肪源干细胞成骨诱导的影响Effectsofretinoicacidintheosteogenicinductiontodermalfibroblastsandadiposederivedstemcells课题来源：自选广东省工业攻关项目(编号：201lB010500004)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院刘玉峰原林教授人体解剖与组织胚胎学学术型硕士基础医学院2013年5月10日广卅f燃掣料硕士学位论文维甲酸对成纤维细胞及脂肪源干细胞成骨诱导的影响硕士研究生：刘玉峰指导教师：原林教授摘要背景：骨组织的损伤与修复一直是

2、临床课题研究的难点与热点。对于骨组织的再生不足的问题，研究者一直期望能够找到适宜的条件或理想的种子细胞来促进骨的再生与修复。2003年原林教授提出的“筋膜学”认为人体是由尚未分化的非特异性结缔组织(筋膜)支架所构成的“支持与储备系统”和以已分化功能细胞为基础的“功能系统”共同构成。支持与储备系统不断的为功能系统的更新和功能活动提供源源不断的营养物质，功能系统在支持与储备系统支持下维持结构与功能的稳定。功能系统的功能发挥要基于已经特化了的功能细胞的基础之上，而支持与储备系统的筋膜支架是以干细胞为核心，通过分化出各种定向干细胞，为功能系统的更新提供源源不断的细胞补充，并为功能系统的各种细胞的

3、更新、代谢提供一个稳定的内部环境。受损组织器官的修复过程实际是支持储备系统中未完全分化的细胞向该组织器官内原有细胞定向分化的补充的过程，并且为功能系统中细胞的新陈代谢提供营养物质，维持其内环境的稳定。间充质细胞的多组织来源与筋膜结缔组织支架的全身分布是一致的，其纵向、横向分化的生物学特性与筋膜学提出的筋膜结缔组织对机体的支持储备作用也是一致的。真皮层的成纤维细胞(DFB)及脂肪源干细胞(ADSCs)都是来源于中胚层的间充质细胞，二者在生物学特性及形态上有相似性，且二者都具有一定的定向分化能力。ADSCs是筋膜中未分化干细胞的一种储备形式，具有多分中文摘要化潜能，能够跨胚层分化。DFB具有

4、产生纤维(胶原纤维、弹性纤维、网状纤维)与有机质的功能，尤其在组织修复过程中其分泌功能更加明显。ADSCs具有低免疫原性，免疫调节功能和分泌细胞因子等能力为异体移植提供了有利条件，使脂肪源干细胞成为生物治疗的亮点之一。人体参与组织损伤与修复的细胞主要是成纤维细胞与未分化的间充质细胞。骨的损伤修复过程大致可分为血肿的机化，骨痂的形成与塑性三个过程。有研究表明在血肿机化过程中，成纤维细胞也参与了成骨分化的过程。如何能够最大限度发挥成纤维细胞的成骨分化潜能一直是研究者关注的焦点。ADSCs由Zuk等人首次发现并提取培养。与其他成体干细胞比较，ADSCs具有来源广泛、取材方便，创伤小且不存在免疫

5、排斥反应等优点。这类细胞具有较强的增殖能力和多向分化潜能，在适当的诱导条件下能向成脂肪、成软骨、成骨、成肌、成神经及心肌等定向分化。传统成骨诱导液成分(DMEM+10％FBS+l％双抗+1％B甘油酸磷酸钠+0．1％地塞米松+0．5％维生素C)已被证实对成纤维细胞及脂肪源干细胞有一定的成骨诱导分化功能，但其具体机制尚待进一步探索和研究。维甲酸(RA)是体内维生素A的代谢中间产物，有研究表明其对间充质细胞的成骨过程有着重要的调节作用。对维甲酸作为成骨诱导因素的研究发现，维甲酸可以促进胎鼠颅骨闭合和牙齿的生长。国内也有研究发现一定浓度的维甲酸可以成纤维细胞内钙结节的沉积。传统成骨诱导液成分与维

6、甲酸二者对间充质细胞的成骨分化诱导效果与机制是否完全相同，这对于间充质细胞作为骨组织工程种子细胞具有重要的意义。目的通过RA与传统成骨诱导液对DFB与ADSCs两类问充质细胞成骨诱导的对比，进一步了解不同种类间充质细胞在成骨方面的差异，从而为筋膜学提供更多的理论依据，并对骨组织工程在骨的再生与修复方面提供更多实践支持。l、分离并离体培养大鼠ADSCs并对其细胞表面标记物及多向分化潜能进行鉴定：硕士学位论文2、分离并离体培养大鼠皮肤DFB并对其进行波形蛋白鉴定；3、分别使用RA与传统成骨诱导液对两类细胞进行为期2周的成骨诱导，检测各项细胞生长指标，如细胞生长曲线，骨碱性磷酸酶活性，茜素红染

7、色，RT-PCR检测骨钙素的表达，分析差异。方法l、取5—7d龄的SD乳鼠背部皮肤，酶消化法分离、培养DFB。通过形态学、免疫组化等手段来鉴定其是否为成纤维细胞。2取同只乳鼠的腹股沟脂肪垫，酶消化法分离培养ADSCs。通过形态学，流式细胞学及多向诱导分化实验鉴定其是否为ADSCs。3、待细胞分别培养并传至第3代，用0．25％胰酶消化下来，用完全培养基重悬，并调整密度为5×104／ml接种于六孔板内。分别用传统成骨诱导液与RA诱导2周