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1、脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序试剂准备(一)成脂分化诱导液(AdipogenicMedium，AM)配方⑴:试剂名称i浓度商品信息1.极限必须培养基(Dulbecco^ModifiedEagleMedium,DMEM)1.0L(SH30021.01B,Hyclone)2.胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS)10%(ES-009-B,Millipore)3.青霉素/链霉素(Penicillin/Streptomycin)1%(TMS-AB2C,CHEMICON)4.地塞米松(Dexamethasone,DM)lpmo/L分子量
2、：392.46(D4902-25MG,Sigma)5.胰岛素(Insulin,IS)10pmol/L分子量：5808(91077C—lg,Sigma)6.3-异丁基亠甲基黄瞟吟(IsobutylmethylxanthineJBMX)0.5mmol/L分子量：222.24(I5879-100MG,Sigma)7.卿味美辛(InclomethacinJD)200pmol/L分子量：357.79(17378—5G,Sigma)(二)成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称:质量浓缩倍数配制方法1.StockA胎牛血清••■■ilml/管1X(liqui
3、d)分装lml/管XI00保存：・20°C2.StockB青霉素/链霉素■■50.1ml/管100X(liquid)分装0.1ml/管Xl()()保存：-2(FCF；3.StockC地塞米松:0.0117738g1000X溶于30ml无水乙醇(0.1%)分装0.1ml/管X300保存：・2()°C4.StockD胰岛素；0.05808g■■■100X溶于10mlHcl(0.1mol/L,PH2.0)分装0.1ml/管X100保存：4°C5.StockE3■异丁基亠甲基黄嚓吟1；0.05556gB200X溶于2.5mlDMSO(().5%)
4、分装().()5ml/EP管X50保存:-20°C6.StockFII引味美辛■■:0.07155g500X溶于2ml无水乙醇(0.2%)分装0.02ml/管X100保存：・20°C(三)成脂分化诱导液工作液配制(10ml)1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管(BD);2.加1管StockA(lml)；3.加1管StockB(0.1ml)；4.取］管StockC(0.1ml)溶解，加入0.01ml；5.加1管StockE(0.05ml)；1.加1管StockF(0.02ml)；2.加1管StockD(0.1ml)；&测渗透压
5、，调pH7.2-7.4;9.0.22pm微孔过滤，4°C贮存,一周内使用。(三)StromalMedium配制(10ml)[21：1.取DMEM8.9m1加入15ml离心管(BD);2.加入1管StockA(lml)；3.加入1管StockB(0.lml)；4.调pH7.2-7.4;5.0.22pm微孔过滤，4°C贮存,一周内使用。（五）0.5%油红“0”配制®汕红“O”0.5g溶于100ml无水乙醇（50%）,分装备用，使用前0.22um滤（六）4%多聚甲醛液配制试剂名称质量/体积甲醛4gPBS100ml调PH7.2-7.4,0.22P
6、fli微孔过滤后使用。二、方法（一）细胞诱导培养⑷1.间充质干细胞传代培养至第三代，待细胞融合至80%左右，从培养箱内取出细胞至垂直超净台；2.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；3.lml微量移液器吸弃培养液；4.加入预温PBS,lml/孔；5.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；6.吸弃PBS；7.重复步骤（4）—（6）,漂洗细胞，2次；8.加入Trypsin/EDTA消化液，lml/孔，5min,37°C；9.加入等fiStromalMedium,终止消化；10.lml微最移液器彻底吹洗111L底，收集细胞悬液至15ml离心管内；1
7、1.1400rpmRT,5min;12.小心取出离心管，吸弃上清；13.加入StromalMedium重悬消化卜•來的细胞；14.按lx10°个/ml接种到24孔板内（此时若解冻细胞,按冻存密度5*105个/ml计算,可铺6孔板10个孔，12孔板25个孔,24孔板50个孔）,加入StromalMedium培养基培养3天，设置对照组（一直使用StromalMedium培养），空白组（添加DMEM覆盖皿底即nJ'）；15.3天后，实验组吸弃原有培养基，换用成脂诱导培养基（AM）；16.每2・3天换液一次;17.诱导2周后，初始脂肪形成时用油红
8、“0"染色进行评估。（二）油红“CT染色：1.从培养箱内取出细胞至普通实验台；2.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；1.lml微量移液器吸弃培养液；2.加入预温PBS,1ml/孔，；3.X、
