脂肪干细胞的提取及鉴定

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1、一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎

2、至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25%Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细

3、胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。2、实验用品：2.1材料：C57BL／6WT小鼠2.2试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒

4、后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。b.取材：取C57BL／6WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。c.消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶,PH），用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于37℃水浴或恒温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。d.离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min10分钟

5、），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min离心10分钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数结果调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。e．接种培养：每10cm2的培养瓶接种1ml的细胞悬液，再添加4ml的培养液，盖紧瓶塞。标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37℃5%CO2孵箱培养。3.2.2观察每天对接种培养的细胞做常规性检查。观

6、察的主要内容：污染与否、细胞生长状态和pH（培养液颜色变化）等情况。如发现培养液变为柠檬黄色有浑浊，表明已被污染，细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。如培养液颜色变为紫色，可能系培养瓶有裂口或瓶塞漏气，CO2逸出或由于细胞生长不良有大量死亡。如培养液为橘红色，一般说明细胞生长状态良好。在没有发生污染，接种24h后，可见到许多细胞贴壁（由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状），24小时后第一次换液，以后3天换液一次。培养3-4天时，细胞生长繁殖，细胞数量增加，并可见细胞形成孤立小片（细胞岛），逐渐扩展，细胞透明

7、，颗粒啥，界线清晰。7-10天细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，（80%融合后）可进行传代培养。3.3细胞传代培养3.3.1操作步骤a．取一瓶脂肪干细胞在倒置相差显微镜下观察，培养细胞如长成致密的单层，即可进行传代。b．将培养瓶带人超净工作台，倒去细胞培养液，吸取2ml-3mlPBS加入培养瓶中，轻轻振荡后倾去，可重复进行一次。c．加入5-8滴0.25%Trypsin,0.02%EDTA，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，置于室温下笑话2-3min。翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜上出现针孔

8、大小空隙时即可倒去消化液。如见消化程度不够时可再延长消化1-2min。如见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能倒去消化液而直接进行下一步操作。d．加入3ml培养液于培养瓶中终止消化。吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，直至瓶壁上的细胞全被冲下，再轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。取样计数，调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。吸取1ml细胞悬液加到另一培养瓶中，原瓶留下1ml细胞悬液，弃去多余悬液（可分别提取1ml接种分配到多个培养瓶中），并向每瓶中加4ml培养液。盖好瓶盖，