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《脂肪干细胞分离提取、鉴定和和脂肪颗粒混合移植探究.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、脂肪干细胞分离提取、鉴定和和脂肪颗粒混合移植探究［摘要］目的分离提取脂肪干细胞(ADSCs),对其进行成脂、成骨的鉴定，并与脂肪颗粒混合移植，观察移植后的脂肪组织的存活情况。方法取大鼠腹股沟脂肪，磷酸盐缓冲液清洗，0.1%I型胶原酶37£消化1h,离心，取沉淀，用含10%血清的DMEM培养基进行培养、传代，取第3代ADSCs用于成脂、成骨鉴定；另取第3代ADSCs用于移植,分为两组：ADSCs(密度为5X107/mL)0.9mL+脂肪颗粒0.6mL组、脂肪颗粒1.5mL组，分别移植于大鼠背部两侧，共移植24只大鼠，分别于2周、1、3个月时脱颈椎处死8只大鼠，再取出背部
2、脂肪组织。结果大鼠ADSCs成脂、成骨诱导后，经油红0、茜素红染色呈阳性，移植2周、1个月时，两组取出的脂肪组织的体积变化不大；但移植3个月后,取背部脂肪组织，称重：脂肪颗粒1.5mL组平均重量为(0.4551±0.0024)g,而ADSCs(密度为5X107/mL)0.9mL+脂肪颗粒0.6mL组的平均重量为(0.7798±0.0033)g,两组脂肪组织的重量差异有统计学意义(P［Keywords］Adipose-derivedstemcells；Adipogenicinduetion；Osteogenicinduction；Transplantation脂肪组织的
3、获得快捷、方便，2001年,Zuk等［1］从脂肪组织中分离到了一种具有多向分化能力的干细胞，即脂肪来源干细胞（ADSCs）,有分化为脂肪、成骨、软骨、成肌等能力[2-3],能够在体外稳定增殖，衰亡率低，少量的组织就可获得大量干细胞，适合大规模培养，是近年来的研究热点之一。单纯脂肪移植很容易出现组织液化吸收、形成纤维囊等问题,这些问题一直没有得到根本解决。本研究引入的ADSCs,具有自我复制和多向分化的能力，能够分泌多种生长因子及细胞因子，所以将ADSCs和脂肪颗粒混合移植[4],会大大提高脂肪组织移植的存活率，降低液化、纤维化、坏死等不良反应[5-6],本文就ADSC
4、s辅助脂肪移植进行研究,旨在探索ADSCs在脂肪移植中的良好作用。1仪器与试药1.1仪器与试剂HH-2恒温水浴锅（国华电器有限公司）；XSP-3CA生物显微镜（上海蔡康光学仪器）。胎牛血清（Gibco,北美）；DMEM培养基（Hyclone,美国）；0.25%胰蛋白酶-EDTACGibco,美国）；I型胶原酶（Sigma，美国）；磷酸盐缓冲液（PBS）（KC10.20g,NaCl8.00g,KH2P040.20g,Na2HP04•12H203.49g,加水至1000mL,pH7.4）；成脂、成骨诱导液和茜素红染液及油红0（赛业生物科技有限公司）。1.2动物12〜14周
5、龄SD雄性大鼠，体质量200〜220灯由中国药科大学动物实验中心提供。2方法与结果2.1ADSCs的提取、培养和传代取大鼠1只，脱颈椎处死，在75%乙醇中浸泡10min后,将大鼠置于超净台上，剪开腹部，取出腹股沟脂肪，用PBS冲洗3遍，去除肉眼可见的血管，再剪至1mm3大小的脂肪碎块，加入2〜3倍体积的0.1%1型胶原酶溶液，37£恒温水浴消化lh,然后，加入等体积的含10%血清的DMEM培养基中和胶原酶，1500r/min离心10min,弃去上层脂肪，沉淀加含10%血清的DMEM培养基重悬,1500r/min离心10min,沉淀加含10%血清的DMEM培养基，分于2
6、个培养瓶中，放于37°C.5%CO2孵箱中培养，每3天换1次液，当细胞长满80%〜90%时，1：2传代。2.2ADSCs的冻存与复苏0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，将ADSCs悬液收集到离心管中，1000r/min离心10min,弃上清液，加入冻存液［DMEM培养基-血清-二甲基亚枫(7:2:1)］调整ADSCs密度在5X106/mL左右，将含ADSCs的冻存液分至冻存管中,每管1mL,按下列顺序程序降温：放置4°C冰箱30min,-20°C冰箱1h,再于液氮罐中保存。ADSCs复苏时，将ADSCs从液氮中取出，迅速置37匸的温水中晃动，使冻存管中的ADSC
7、s冻存液在1min内融化，将ADSCs悬液吸到离心管中，1000r/min离心10min,弃上清，沉淀加含10%血清的DMEM培养基，吹打均匀，再转移至培养瓶中，37°C,5%CO2孵箱中培养。2.2ADSCs的成脂、成骨鉴定将第3代细胞消化接种于6孔板中，用于成脂、成骨实验。2.3.1成脂鉴定当细胞汇合100%时，换成成脂诱导液A,3d后换成维持培养液B,经过成脂诱导/维持3次循环后，用维持培养液再培养1周，进行油红0染色，吸去诱导液，PBS洗3次，加入10%中性甲醛溶液，固定30min,吸去固定液，加入油红0,37°C染色30min,再加入PBS
