脂肪干细胞分离提取、鉴定和和脂肪颗粒混合移植探究

《脂肪干细胞分离提取、鉴定和和脂肪颗粒混合移植探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、脂肪干细胞分离提取、鉴定和和脂肪颗粒混合移植探究　　[摘要]目的分离提取脂肪干细胞（ADSCs），对其进行成脂、成骨的鉴定，并与脂肪颗粒混合移植，观察移植后的脂肪组织的存活情况。方法取大鼠腹股沟脂肪，磷酸盐缓冲液清洗，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化1h，离心，取沉淀，用含10%血清的DMEM培养基进行培养、传代，取第3代ADSCs用于成脂、成骨鉴定；另取第3代ADSCs用于移植，分为两组：ADSCs（密度为5×107/mL）0.9mL+脂肪颗粒0.6mL组、脂肪颗粒1.5mL组，分别移植于大鼠背部两侧，共移植24只大鼠，分别于2周、1

2、、3个月时脱颈椎处死8只大鼠，再取出背部脂肪组织。结果大鼠ADSCs成脂、成骨诱导后，经油红O、茜素红染色呈阳性，移植2周、1个月时，两组取出的脂肪组织的体积变化不大；但移植3个月后，取背部脂肪组织，称重：脂肪颗粒1.5mL组平均重量为（0.4551±0.0024）g，而ADSCs（密度为5×107/mL）0.9mL+脂肪颗粒0.6mL组的平均重量为（0.7798±0.0033）g，两组脂肪组织的重量差异有统计学意义（P　　[Keywords]Adipose-derivedstemcells；Adipogenicinduction；

3、Osteogenicinduction；Transplantation8脂肪组织的获得快捷、方便，2001年，Zuk等[1]从脂肪组织中分离到了一种具有多向分化能力的干细胞，即脂肪来源干细胞（ADSCs），有分化为脂肪、成骨、软骨、成肌等能力[2-3]，能够在体外稳定增殖，衰亡率低，少量的组织就可获得大量干细胞，适合大规模培养，是近年来的研究热点之一。单纯脂肪移植很容易出现组织液化吸收、形成纤维囊等问题，这些问题一直没有得到根本解决。本研究引入的ADSCs，具有自我复制和多向分化的能力，能够分泌多种生长因子及细胞因子，所以将ADSC

4、s和脂肪颗粒混合移植[4]，会大大提高脂肪组织移植的存活率，降低液化、纤维化、坏死等不良反应[5-6]，本文就ADSCs辅助脂肪移植进行研究，旨在探索ADSCs在脂肪移植中的良好作用。1仪器与试药1.1仪器与试剂HH-2恒温水浴锅（国华电器有限公司）；XSP-3CA生物显微镜（上海蔡康光学仪器）。胎牛血清（Gibco，北美）；DMEM培养基（Hyclone，美国）；0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco，美国）；Ⅰ型胶原酶（Sigma，美国）；磷酸盐缓冲液（PBS）（KCl0.20g，NaCl8.00g，KH2PO40.20g，N

5、a2HPO4·12H2O3.49g，加水至1000mL，pH7.4）；成脂、成骨诱导液和茜素红染液及油红O（赛业生物科技有限公司）。1.2动物812～14周龄SD雄性大鼠，体质量200～220g，由中国药科大学动物实验中心提供。2方法与结果2.1ADSCs的提取、培养和传代取大鼠1只，脱颈椎处死，在75%乙醇中浸泡10min后，将大鼠置于超净台上，剪开腹部，取出腹股沟脂肪，用PBS冲洗3遍，去除肉眼可见的血管，再剪至1mm3大小的脂肪碎块，加入2～3倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，37℃恒温水浴消化1h，然后，加入等体积的含10%血

6、清的DMEM培养基中和胶原酶，1500r/min离心10min，弃去上层脂肪，沉淀加含10%血清的DMEM培养基重悬，1500r/min离心10min，沉淀加含10%血清的DMEM培养基，分于2个培养瓶中，放于37℃、5%CO2孵箱中培养，每3天换1次液，当细胞长满80%～90%时，1∶2传代。2.2ADSCs的冻存与复苏0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，将ADSCs悬液收集到离心管中，1000r/min离心10min，弃上清液，加入冻存液[DMEM培养基-血清-二甲基亚砜（7∶2∶1）]调整ADSCs密度在5×106/mL

7、左右，将含ADSCs的冻存液分至冻存管中，每管1mL，按下列顺序程序降温：放置4℃冰箱30min，-20℃冰箱18h，再于液氮罐中保存。ADSCs复苏时，将ADSCs从液氮中取出，迅速置37℃的温水中晃动，使冻存管中的ADSCs冻存液在1min内融化，将ADSCs悬液吸到离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀加含10%血清的DMEM培养基，吹打均匀，再转移至培养瓶中，37℃，5%CO2孵箱中培养。2.3ADSCs的成脂、成骨鉴定将第3代细胞消化接种于6孔板中，用于成脂、成骨实验。2.3.1成脂鉴定当细胞汇合100%

8、时，换成成脂诱导液A，3d后换成维持培养液B，经过成脂诱导/维持3次循环后，用维持培养液再培养1周，进行油红O染色，吸去诱导液，PBS洗3次，加入10%中性甲醛溶液，固定30min，吸去固定液，加入油红O，37℃染色30min，再加入