幽门螺杆菌napa基因克隆表达和免疫原性初步的研究

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1、中国协和医科大学中国医学科学院硕士研究生毕业论文论文声明论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它结构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：垫鱼当日期：竺Z：!：竺论文使用授权声明本人完全了解中国医学科学院中国协和医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印，缩印或其它复制手段保存论文，保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：热

2、堡盘导师签名：．耋邀日期：鲨迸妇!塑中国协和医科大学中国医学科学院硕士研究生毕业论文摘要摘要幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hpylori，王≯)是一种微需氧革兰氏阴性螺旋杆菌，在全球人口中的感染率超过50％。Hpylori感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃癌、胃粘膜相关性淋巴样组织(Mucosa。associatedlymphoidtissue，MAIT)淋巴瘤的发生密切相关，被WHO确定为I类致癌因子。研制疫苗将是控制H．pylori感染及相关疾病经济有效的途径。幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(H．pylorineutropphil—activatin

3、gprotein，HP．NAP)位于细菌细胞质中，可通过细菌自溶而释放，并附着在细菌外膜表面，介导了Hpylori与细胞表面的结合。其能够趋化和激活中性粒细胞，导致炎症。而最新实验表明，HP．NAP在酸性条件下，能够结合甚至浓缩DNA，以保护DNA免受宿主环境的损伤。可见，HP．NAP在H．pylori的粘附、定植，以及引起的炎症反应中都起到重要作用，是H．pylori重要的致病因子之一。本实验尝试了采用基因工程的方法获得NAP蛋白，并对其免疫原性进行了初步的研究。用PCR从标准株上≯26695基因组中扩增napA基因，并构建原核表达载体pET28a--nap。测序证实克隆片段与

4、GenBank公布序列完全一致。优化表达条件后，pET28a--nap在大肠杆菌中获得大量表达，表达量占菌体蛋白总量的40％。经Chelating．F．F．亲和柱层析SephacrylS-200分子筛柱层析后，获得了95％以上纯度的融合蛋白。与佐剂CpGODN和LTB联合口服免疫小鼠后，可有效诱导免疫应答，产生高水平的培G，与未加佐剂组相比具有显著性差异。以上结果说明融合蛋白NAP联合佐剂经口服免疫可有效诱导实验动物产生免疫应答，NAP具有良好的免疫原性。本研究成功构建了融合蛋白表达载体，并获得了高效的表达。摸索了纯化方案，并对融合蛋白的免疫原性进行了初步的研究。为肋基因工程疫苗

5、的研究和开发打下了一定的基础。关键词：幽门螺杆菌；napA基因；中性粒细胞激活蛋白；免疫原性中国协和医科大学中国医学科学院硕士研究生毕业论文摘要ABsTRACTHelicobacterpyloriisaGram-negativemicroaerophilicbacillusthatinfectsthestomachsofmorethanhalfoftheglobalpopulation．IthasbeenconfirmedthatH．py／or／isthemainCauseofchronicgastritisandpepticulcerdisease，andhasaclosere

6、lationtogastricmucosa·associatedlymphoidtissue(MALT)lymphnmaandgastricadenocarcinoma．TheWorldHealthOrganizationdefineditasaclass1Carcinogen．Vaccinewillbeaneffectiveandeconomicapproachtopreventinfectiondiseasesofmasspopulation．H．pylorineutropphil—activatingprotein(HP·NAP)islocalizedinthebacter

7、ialcytosolandisreleaseduponautolysis．ItCaUbindtotheexternalsurfaceoftheoutermembraneandmediatethebindingofH．pyloritothecellsurface．NAPhasalsobeenshowntobechemotacticforneutrophilsandmonocytes．whichcontributeto晟pylori—inducedgastritis．Itisable