胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆、表达及免疫原性研究

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1、胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆、表达及免疫原性研究研究生：富亮指导教师：赵玉军教授徐福洲博士专业名称：预防兽医学研究方向：动物传染病学所在学院：畜牧兽医学院胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆、表达及免疫原性研究第一章前言第二章apxⅠA基因的克隆与原核表达第三章apxⅠA表达蛋白的免疫原性研究猪传染性胸膜肺炎概况猪传染性胸膜肺炎（Porcinecontagiouspleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，APP）引起的

2、猪的呼吸道疾病，其病理特征是引起肺脏广泛的纤维素性渗出、坏死、出血、胸膜粘连，中性细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞的浸润，血管栓塞，纤维素沉积等。各种年龄猪对该病均易感，新疫区常急性爆发，急性感染尤其是24～25日龄仔猪感染后表现出极高的发病率和死亡率，发病仔猪迅速死亡，死亡率达到20％以上，最急性型可达80％～100％，并且长期带菌而成为传染性胸膜肺炎再次爆发和流行的潜在传染源，给本病的控制和根除带来困难。同时本病在临床上常与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒等混合感染，给养猪业造

3、成巨大的经济损失。该病是国际上公认的危害现代养猪业的重大疫病之一。胸膜肺炎放线杆菌概述胸膜肺炎放线杆菌（ActinobacilluspleuropneumoniaeAPP），属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae）放线杆菌属（Actinobacillus）。APP是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜，有菌毛，不形成芽胞，无运动性，最近还发现该菌有鞭毛。胸膜肺炎放线杆菌分两个生物型，即生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型为辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NicotinamideAdenineDinucleo

4、tide，NAD）依赖型，生物Ⅱ型为非NAD依赖型。血清型是根据APP表面荚膜和脂多糖抗原性的不同来划分的，现已发现15种血清型，1型-12型、15型属于生物Ⅰ型，13、14型属于生物Ⅱ型。APP菌体形态（G－）APP主要毒力因子溶血素（Apx毒素）脂多糖（LPS）荚膜多糖(CPS)外膜蛋白(OMP)尿素酶(Urease)转铁结合蛋白（Tbp）粘附素溶血外毒素（Apx毒素）APP产生的溶血外毒素Apx被认为是APP最重要的毒力因子。在APP的15个血清型中，目前已发现产生四种不同的溶血毒素（Repe

5、atsinthestructuraltoxin，RTX），称为Apx（Actinobacilluspleuropneumoniae-RTX-toxin，Apx），即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。ApxⅠ的毒性最强，表观分子量为105-110kDa，具有很强的溶血活性和细胞毒性作用，分泌ApxⅠ的血清型有1、5、9、10和11。毒素Ⅰ型的操纵子包括：毒素激活基因apxⅠC，毒素结构蛋白基因apxⅠA，两个分泌基因apxⅠB和apxⅠD，其中apxⅠC负责编码毒素激活蛋白，apxⅠA编码毒素结

6、构蛋白，apxⅠB和apxⅠD与毒素的分泌有关。apxⅠA基因的N端疏水区是ApxⅠ的免疫原区，apxⅠA基因的C端是Ca2+结合区只对毒素发挥毒性产生作用。ApxⅡ毒素的表观分子量为103kDa～105kDa，除血清型10以外，其他血清型都可以分泌此毒素。ApxⅡ具有弱的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞也有细胞毒性作用。ApxⅢ毒素的表观分子量为120kDa，是由2、3、4、6、8型APP菌分泌的，ApxⅢ没有溶血活性，但对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞有很强的细胞毒性作用。ApxⅣ毒素是新近

7、发现的。研究人员发现任何血清型都能在体内分泌ApxⅣ毒素蛋白，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。当apxⅣA与表达载体上的开放阅读框1（ORF1）在大肠杆菌中表达时，它有微弱的溶血活性和协同溶血作用（cAMP）。不同Apx毒素的生物学特性Apx毒素类型溶血活性细胞毒性分子量（kDa）分泌的血清型ApxⅠ强强105-1101、5、9、10、11ApxⅡ弱中103-105除了10型以外ApxⅢ无强1202、3、4、6、8ApxⅣ弱弱200所有血清型Apx操纵子基本结构CABD毒素激活基因毒素结构蛋白基因

8、毒素分泌基因胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆与原核表达技术路线：apxⅠA基因的克隆与测序重组表达质粒的构建与鉴定诱导表达诱导表达条件的优化PCR鉴定双酶切鉴定WesternBlotting不同时间不同IPTG浓度不同温度apxⅠA基因的扩增引物设计参照GenBank中apxⅠA核酸序列（D16582），应用Primer5.0软件设计1对引物，其上下游引物中分别含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，预期扩增长度为3158bp，由北京三博远志生物技术有限公司合成。上游引