胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白克隆表达及多重荧光pcr诊断方法的研究

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1、胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白的克隆表达及多重荧光POR诊断方法的研究中文摘要猪传染性胸膜肺炎(Porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一种猪的高度接触性传染病，针对胸膜肺炎放线杆菌血清型众多，．现有疫苗缺乏交叉保护力，对规模化养猪业造成巨大经济损失的现状，研究开发具有交叉保护力的新型疫苗迫在眉睫。研究发现Apx毒素是APP的主要保护性抗原，可提高疫苗灭活疫苗的保护作用。天然毒素提取产量低、过程繁

2、琐且成本较高，利用体外克隆表达编码Apx毒素结构蛋白的基因，获得的重组蛋白与天然提取的毒素免疫原性无明显差异，可为下一步新型疫苗多肽成分和ELISA诊断抗原的研究做充分准备。ApxlV是近年新发现的一个具有APP种属特异性的抗原，只存在于自然感染的动物体内，不会与其它放线杆菌和革兰氏阴性杆菌发生交叉反应。编码ApxlV毒素结构蛋白的apxlVA基因C端特异性和保守性均很强，是首选的诊断抗原和靶基因。本研究运用蛋白质软件Anthe5．0分析了APP的两个关键毒力因子ApxIA和ApxlIA的抗原性和亲水性，截取其中主要抗原

3、位点相对集中的核心区域，分别从胸膜肺炎放线杆菌血清l型国内参考株259和血清7型国内参考株265中扩增了apxlA和apxlIA毒素基因，进行体外克隆，构建了原核表达载体pGEX．4T-1／apxlA和pET32a／apxlIA以及真核表达载体pPICZaA／apxlA；并用T4连接酶串连apxlA和apxlIA基因，构建了该融合基因的原核表达载体pGEX-4T-1／apxlA．apxlIA；从胸膜肺炎放线杆菌血清l型国内参考株259中扩增apxlVA毒素C端特异和保守的一段基因，进行体外克隆，构建了原核表达载体pGEX

4、．4T-1／apxlVA。H以上四个原核表达载体分别在大肠杆菌DH5a、BL21和ToplO’F中以IPTG进行诱导表达，ApxIA、hpxUi、ApxIA-ApxIIA及ApxIVA在大肠杆菌中均以包涵体形式表达，表达的重组融合蛋白分别占菌体总蛋白的32％、23％、19％和40％，利用溶菌酶和超声波对重组菌进行分次裂解，除去大部分可溶的菌体蛋白，再用GlutathioneSepharose4B或Ni-NTA对相应产物进行进一步过柱纯化，最终获得的重组融合蛋白纯度在92％--,98％之间，Western-blot的结果表

5、明以上蛋自均具有良好的反应原性，可直接用于ELISA诊断抗原或新型疫苗多肽成分的研究口ApxIA的真核表达载体经甲醇诱导，在毕赤酵母GSll5中以低水平分泌表达至培养液上清，经40倍浓缩才能检测到目的蛋白，同时从重组酵母总RNA中检测到apxlA基因的mRNA，可以证实目的基因发生了转录。经分析，造成apxlA基因在毕赤酵母系统中低水平表达的原因可能是：一、组成目的基因的密码子对于毕赤酵母的偏好指数极低；二、大量的酵母稀有密码子使得臣的基因中tRNA丰度较低，导致翻译过程出现瓶颈效应；三、目的基因的高AT含量使酵母表达的

6、转录提前终止。猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒Ⅱ型在临床上共感染较为普遍，都以侵害呼吸系统为主，根据胸膜肺炎放线杆菌apxlVA基因和猪圆环病毒I至型ORF2基因中最特异最保守的片段分别设计引物和荧光标记TaqMan探针，建立了可同时鉴别诊断猪传染性胸膜肺炎和猪圆巧病毒珏型的实时定量荧光PCR方法，与其它经常发生混合感染的猪繁殖呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(HCV)、伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(母)、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌等病原体均无交叉反应。该方法用于检测APP和PCV2DNA的敏感度分别达

7、到lxl01拷贝和1xlOo拷贝，并且在两种病原的模板浓度相差105个拷贝时仍可以同时被检出。建立了APP和PCV2两种单重的TaqMan探针荧光实时定量PCR检测方法。所建立的诊断方法快速便捷、特异性好、敏感度高，对早期的快速诊断和筛查以及I!I病原的净化具有很高的实用价值。关键词：胸膜肺炎放线杆菌；Apx毒素；表达：圆环病毒；荧光PCRIVCLoNlNGANDEXPRESSING0FAPX0FAC譬INoBAC王LLUSPLEUROPNEUMoN薹AEANDSTUDYoFMUIJIPLEXREAL．TIMEPCRAB

8、STRACTPorcinecontagiouspleuropneumoniaisaseriouscontactedinfectiousdiseaseofporcinecausedbyActinobacilluspleuropneumoniaewhichownsmultitudeserotype．Basedonthed