抗猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIV毒素单克隆抗体的制备及初步应用.pdf

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1、中国动物传染病学报2009，17(4)：36—42ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases·研究论文·抗猪胸膜肺炎放线杆菌ApxlV毒素单克隆抗体的制备及初步应用张志妮，张伟娟，林燕清，顾万军，黄良宗，朱军，姚丰华，朱国强(1．扬州大学兽医学院，扬州225009；2．佛山科学技术学院生命科学学院，佛山528231)摘要：据猪胸膜肺炎放线杆茵(Actinobacilluspleuropneumoniae，App)apxⅣ毒素基因5端的保守区域设计一对特异性引物，应用PCR方法扩增出致病性App1～12血清型菌株的保守5端

2、序列片段，构建的重组质粒pETapxIVN经IPTG诱导表达出分子量大小为35．3kDa的可溶性重组蛋白。以亲和层析试剂盒纯化的重组蛋白免疫BAIB／c小鼠制备抗ApxIV毒素单克隆抗体(McAb)。以间接ELISA法筛选到两株分泌稳定、抗体亚类均为IgG1的杂交瘤细胞5H7和5C11，其培养上清和小鼠腹水抗体效价分别为1：64、1：128和1：64000、1：128000．两株单抗与临床猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪呼吸道繁殖障碍综合征病毒、猪黄、白痢产肠毒素大肠杆菌和猪肺疫多杀性巴氏杆菌感染阳性血清均不发生交叉反应，显示出良好的特异性．竞争性结合试验表明两株单

3、抗识别不同的抗原结合表位．以(NH)2S()4盐析法纯化的5C11小鼠腹水单抗包被酶标板，生物素标记纯化的5B7单抗建立了检测Apxl~[毒素的双抗体夹心E1ISA法，其包被单抗最佳工作浓度为4／lg／ml，生物素标记单抗最佳_7-作浓度为0．8／lg／mI，对重组表达ApxIV毒素(rApxlV)的最低检出量为60pg／mL。从1O份临床病猪血清样本中检出6份ApxlV毒素阳性，与细菌分离鉴定和PCR结果相符合，结果表明此法可用于App感染的临床诊断。关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌；ApxⅣ毒素；表达；单克隆抗体中图分类号：S858．282．619：Q785文

4、献标识码：A文章编号：1674—6422(2009)04—0036—07DEVELoPMENTANDPRIMARYAPPLICATIoNoFMoNoCLoNALANTIBoDIESAGAINSTAPXⅣoFACTINoBACILLUSPLEURoPNEUMoNlAEZHANGZhi～ni，ZHANGWei-juan，LINYan—qing，GUWan_u，HUANGLiang—zongz，ZHUJun，YAOFeng—hua，ZHUGuo—qiang(J．CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangz

5、hou225009，China；2．Schoolo／’LfeScience，FoshanUniversity，Foshan528231，China))Abstract：TheN—terminalconservedsequencesofapxIVgenefromActinobacilluspleuropneumoniae(App)serotypes1～12wereamplifiedbyPCRandclonedintotheprokaryoticplasmidpET-22b(+)toconstruCtrecombinantplasmidpETapxIVN．A35

6、．3kDasolublerecombinantprotein(rApxIVN)wereexpressedandpurifiedbyNi—TED(tris—carboxymethylethylenediamine)immobilizedmetalionaffinitychromatography(IMAC)．BALB／cmicewereimmunizedwithpurifiedrApxIVNandtwohybridomacelllinessecretingmonoclonalantibodies(MAbs)of5B7and5Cllwereidentified．

7、TheELISAtitersof5B7收稿Et期：2009—10—10基金项目：国家十一五科技支撑项目(2006BAD06A12)作者简介：张志妮，女，硕士研究生，主要从事病原微生物学研究通讯作者：朱围强，E-mail：yzgqzhu@hotmail．com第17卷第4期张志妮：抗猪胸膜肺炎放线杆菌ApxlV毒素单克隆抗体的制备及初步应用一37and5Cllwere1：64and1：128inculturesupernatants，and1：64000and1：128000inascites．BothMAbsshowednocross—reactionswi

8、thporcineseraofclassicalsw