htertp调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞实验的研究

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1、中南大学硕士学位论文hTERTp调控TK基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究姓名：徐芳申请学位级别：硕士专业：耳鼻咽喉头颈外科指导教师：邱元正20070501中南大学硕士学位论文摘要目的：构建端粒酶催化亚单位启动子／胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp／TK)肿瘤特异性表达系统，并探讨其靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应。方法：克隆hTERT启动子及TK基因，酶切后连接到pGL3载体上，构建hTERTp／pGL3，TK／pGL3，hTERTp／TK／pGL3重组载体。用CMV作为实验阳性对照，并应用类似方法构建CMV／TK／pGL3重组质粒；通过RT-PCR方法，

2、用脂质体分别将hTERTp／pGL3，TK／pGL3，hTERTp／TK／pGL3及CMV／TK／pGL3瞬时转染至鼻咽癌HNEl细胞和正常成纤维细胞，24h后加入GCV，观察细胞的形态，检测鼻咽癌细胞的凋亡。48h后收获细胞，检测转染细胞中端粒酶及其亚单位hTERTp和TK基因的表达，并采用MTT法进行比较以检测其每组细胞活性。结果：采用双酶切鉴定hTERTp／I；IGL3、TK／pGL3、hTERTp／TK／pGL3及CMV／TK／pGL3重组质粒，均显示构建成功。荧光素酶活性检测实验显示CMV／pGL3活性强于hTERTp／pGL3，瞬时转染鼻咽

3、癌HNEl细胞显示hTERTp／TK／pGL3杀伤鼻咽癌HNEl细胞效果明显高于hTERTp／pGL3、TK／pGL3对照组，但是低于CMV／TK／pGL3阳性对照组。转染hTERTp／TK／pGL3及CMV／TK／pGL3至鼻咽癌I-IN-E1细胞后TK基因的表达较hTERTp／pGL3、TK／pGL3对照组明显升高，端粒酶及其亚单位hTERTp的表达均较CMVflK／pGL3阳性对照组降低。结论：hTERTp调控TK基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞作用。关键词：hTERT启动子，TK自杀基因，pGL3载体，鼻咽癌中南大学硕士学位论文英文摘要

4、ABSTRACTPURPoSE：ToconstructhumanTclomeraseReverseTranscriptasePromoter／TKspecifctumor-specificexpressingsystem，andinvestigateitsdirectionaleffectofkillingandwoundingtheNasopharyngealcarcinomatumorcells．MElll0DS：ThehTERTpromoterandTKgenewerecloned，andwhichwasconnectedtothePGL3car

5、rierafterenzymedigestion,toconstructtheh1ERTp／PGL3、TK／PGL3、h1ERTp／TK／PGL3recombinantcarriers．andthentoconstructtheC^正Vm(伊GL3recombinantcarrierswiththesimilarmethodandregardCM[vasthepositivecontr01．ThehTERTp／PGL3、TK伊GL3、111ERTp／TK／PGL3andCMV，IK巾GL3weretransfectedintothenasopharyn

6、gealcarcinomaHNElcellsandthenormalfibroblasttransiently,withtheapplicationofbangosomethroughR1'-PC＆After24hours，itwasaddedinGC、‘toexaminetheappearanceofthecell．anddetectthedeathofnasopharyngealcarcinomacell．After48hours，thecellwasharvestedtodetecttheexpressionoftelomeraseanditss

7、ubunithTERTandTKgeneinthetrailsfectioncell．anddetectthecytoactivewith～ⅡT．RESULTS：Therewasasuccessfjll

8、constructioninidentifyIlTERTp／PGL3、1K／PGL3、hTERTp／TK／PGL3andCAnr仍<／PGL3recombinantplasmidbydoubledigestionwithrestrictionendonucleases．Theluciferaseactivitytestmanifestedthatthe

9、activityofC～Ⅳ伊GL3issuperiortohTERTp／PGL3．theeff