端粒酶催化亚单位启动子(hTERTp)调控胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(TK)靶向性杀伤鼻咽癌细胞中CD133_%27%2b_细胞的实验研究

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1、南方医科大学硕士学位论文端粒酶催化亚单位启动子（hTERTp）调控胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因（TK）靶向性杀伤鼻咽癌细胞中CD133<'+>细胞的实验研究姓名：关小芳申请学位级别：硕士专业：耳鼻咽喉-头颈外科学指导教师：文忠20090418硕士学位论文端粒酶催化亚单位启动子(hTERTp)调控胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(TK)靶向性杀伤鼻咽癌细胞中CDl33+细胞的实验研究硕士研究生：关小芳指导老师：文忠教授樯耍研究背景鼻咽癌(NasopharyngealCarcinoma,NPC)是我国南方及东南亚各国发病率高，危害大的恶性肿瘤之一，严重威胁和影响人们的生命健康和生活质量。

2、目前，临床仍以放射治疗作为鼻咽癌治疗的首选方法，虽然近年来放疗设备、技术及方法在不断的进步，但鼻咽癌的5年生存率、治愈率仍然维持在50％左右，并未从根本上改善治疗效果，且放疗本身带来的局部及全身副反应也给病人造成了身体及心理上的极大伤害，严重影响了治疗效果。因此，探索鼻咽癌的病因并针对其研究新的有效治疗方法尤为重要。近年来，一种新的肿瘤起源学说，即肿瘤干细胞学说正逐渐被大家所认可。肿瘤干细胞(tumorstemcell，TSC)是指存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体，具有自我更新能力和不定向分化潜能，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断生长的根源，是肿瘤发

3、生、扩散、复发等过程中的起始细胞。到目前为止，已从白血病、乳腺癌、脑肿瘤、肺癌、前列腺癌等肿瘤中成功分离出肿瘤干细胞。自ToruKondo等发现多种已建系的肿瘤细胞系中存在少量的肿瘤干细胞后，肿瘤细胞系作为肿瘤研究的经典模型有了一定的进展。国内研究也发现，人脑胶质瘤细胞在含生长因子的无血清培养基中能形成细胞球，而这种细胞球中文摘要富集了肿瘤干细胞，因而称之为脑肿瘤干细胞球。另外，国外有研究表明，肿瘤干细胞中具有较高的端粒酶活性，肿瘤干细胞与端粒酶系统之间的密切关系可以解释肿瘤干细胞的无限增殖潜能及其恶性转化潜能，即端粒酶高活性可能是支撑肿瘤干细胞恶性转化的“动力源泉”，这

4、为我们深入研究提供了切入点。到目前为止，研究鼻咽癌细胞系中肿瘤干细胞的报道不多。因此，本实验选取一株人鼻咽癌SUNE细胞系，试图通过肿瘤干细胞特异的表面标记CDl33，采用免疫磁珠分选的方法分离肿瘤干细胞，用特殊的含生长因子的无血清培养基培养鼻咽癌干细胞，并根据肿瘤干细胞特有的能够自我更新和不定向分化能力对其进行鉴定，同时检测其端粒酶活性，最后将我们已构建的hTERT启动子调控TK自杀基因的特异性表达载体(hTERT／TK／pGL3)，转染经免疫磁珠分选并证实的鼻咽癌干细胞中，探讨以上特异表达载体对鼻咽癌干细胞的靶向杀灭作用以及对其端粒酶系统活性的改变。研究目的研究CDl

5、33在人鼻咽癌细胞株SUNE中的表达，检测CDl33+肿瘤细胞体外增殖分化情况，对其进行肿瘤干细胞的鉴定；探讨端粒酶催化亚单位启动子／胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(hTERTp／TK)肿瘤特异表达系统，对鼻咽癌细胞株SUNE中鼻咽癌干细胞端粒酶活性的影响及靶向性杀伤作用。实验方法1、SUNE细胞株的培养：鼻咽癌细胞株SUNE培养在含10％新生牛血清的RPMI1640完全培养液中，置于5％C02、37"(2饱和温度的培养箱中培养，当细胞生长到铺满培养瓶底80％时按1：2或1：3传代培养。2、流式细胞仪检测SUNE细胞中CDl33的表达：计数约107的SUNE细胞，经胰酶消化处理

6、、0．01％PBS洗涤，去上清、加入藻红蛋白(phycoerythrim，PE)标记的．CDl33抗体10I．tL、FcR阻断剂20I_tL、buffer80I-tL，充分混匀后避光4"C冷却10min，buffer洗涤、重悬、离心、去上清，加500pLbuffer重悬细胞、上机分析。3、免疫细胞化学方法观察鼻咽癌SUNE细胞中CDl33的表达：计数SUNEⅡ硕士学位论文细胞约5X104,接种在培养皿中的小盖玻片上，待细胞贴壁后培养2"-'3d。4％多聚甲醛在室温下固定15．20min，PBS洗涤，1％的小牛血清封闭30min，吸除封闭剂。加PE标记的CDl33抗体2．5

7、I_tL，避光4"C冷却30min。0．01％PBS洗涤，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察。4、免疫磁珠技术分选SUNE中CDl33+细胞：取总量为107数量级的细胞，经胰酶消化，buffer洗涤、重悬、离心、去上清。3001．tLbuffer重悬细胞，加入FC受体100此，抗CDl33免疫磁珠100rtL，充分混匀后4．-一8"C避光结合30min。5rnlbuffer重悬，离心300rpm／min10rain，弃上清液，O．5mlbuffer重悬细胞，安装磁珠分选架和LS柱，3mlbuffer湿柱，将0．5mlbuffer重悬