缺氧调控端粒酶活性及抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文缺氧调控端粒酶活性及抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究Down-regulationoftelomeraseanditshTERTandinhibitingofcancercelllineinducedbyhypoxiainnasopharyngealcarcinoma课题来源：自选课题学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会委员史欣文忠教授耳鼻咽喉科学学术型硕士研究生第二临床医学院文卫平教授谢民强教授于锋教授梁勇教授龙孝斌教授2014年4月20日广州硕士学位论文缺

2、氧调控端粒酶活性及抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究硕士研究生：史欣指导教师：文忠教授摘要背景缺氧对包括鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)在内的恶性肿瘤的血管形成、肿瘤增殖、耐药、转移及凋亡等多方面显著相关。但缺氧导致肿瘤恶性转化的机制到目前为止还不是很清楚。已有研究证实核转录因子HIF．1(hypoxiainduciblefactor．1，HIF．1)在缺氧引起的肿瘤生长和恶性进展中起着枢纽作用。我们在鼻咽癌前期研究中发现，端粒酶及其亚单位(telomerasecatalyticsubunit，hTE

3、RT)在包括鼻咽癌在内的绝大多数恶性肿瘤中高表达，端粒酶高活性是导致恶性肿瘤无限增殖、复发转移的重要原因。目前研究发现，缺氧所导致的上调肿瘤生长、转移及化疗耐药作用有可能是通过上调肿瘤细胞端粒酶活性实现的，且核转录因子HIF．1在调节中起着关键作用。基于鼻咽癌与端粒酶的密切关系，本研究拟探讨缺氧对鼻咽癌细胞端粒酶及其亚单位活性的作用以及对鼻咽癌细胞增殖、转移及化疗耐药等生物学行为的影响；siRNA干扰HIFla后对鼻咽癌细胞端粒酶及其亚单位活性抑制作用及对鼻咽癌细胞增殖及转移抑制、逆转耐药的影响。进一步为肿瘤缺氧提供新的见解，

4、作为癌症治疗的新靶点。目的探讨缺氧及干预因素对鼻咽癌细胞端粒酶及其亚单位活性的作用以及对鼻中文摘要咽癌细胞增殖、转移及化疗耐药生物学行为的影响。研究内容和方法1．细胞培养及缺氧处理5—8F和CNE2细胞在标准状态下(5％C02、37。C)培养于含10％胎牛血清、1％双抗(青霉素100U／mL，链霉素10099／mL)的RPMI．1640培养基中。倒置显微镜下观察细胞的形态。常规使用0．25％胰酶(含EDTA)消化传代。所有实验均选用处于对数生长期细胞。缺氧处理，细胞经实验处理后，由常氧C02培养箱转移至已调节稳定的三气培养箱中

5、(包含1％02，5％C02，和94％N2)。2．缺氧对鼻咽癌细胞端粒酶及其亚单位活性作用的影响2．1缺氧对鼻咽癌细胞HIFla和hTERT基因表达的影响5．8F和CNE2细胞培养于6孔板，将未融合的细胞缺氧培养0h-72h，采用SDS裂解液提取细胞总蛋白，BCA法对蛋白进行定量，免疫印迹法检测各个时间点(0、4、8、16、24、48、72h)HIFla和hTERT蛋白的相对表达量。以B．actin为内参。2．2鼻咽癌细胞瞬时转染HIFla．siRNA并检测其转染率5-8F和CNE2细胞以2～2．5x105个／：fL的密度接种于

6、6孔细胞培养板(96孔板为5x103个／-TL)，12小时后细胞密度达到30％～50％，更换无血清培养基。按照说明书，采用Lipofectamine2000转染siRNA，siRNA转染的终浓度为30nM。Negative-siRNA标记有Cy3荧光，6h后荧光显微镜观察转染细胞，流式细胞仪检测转染率，每批细胞设3个复孔。2．3筛选沉默HIFla效果最好的siRNA5．8F和CNE2细胞分别转染3对siRNA(HIFla．siRNA．1、HIFlot．siRNA．2和HIFla—siRNA一3)、Negative—siRNA和

7、转染间质Lipofactamine2000，常氧或缺氧培养48h，荧光定量PCR法检测HIFlamRNA的相对表达量，实验重复3次，同时扩增13-actin作为内参。然后筛选出能有效抑制HIFla表达的siRNA序列。2．4HIFla—siRNA沉默HIFla后对HIFla及hTERT基因表达的影响TT硕士学位论文5—8F和CNE2细胞转染HIF1ot。siRNA和Negative．siRNA，常氧或缺氧培养48h，采用荧光定量PCR法和免疫印迹法检测HIFla和hTERT基因mRNA及蛋白的相对表达量，实验重复3次。3．HI

8、Fla．siRNA抑制HIFla对鼻咽癌细胞增殖、转移及耐药性的影响3．1鼻咽癌细胞周期检测实验分4组：未处理组(常氧)、未处理组(缺氧)、HIFla．siRNA组(缺氧)和Negative—siRNA组(缺氧)。CNE2和5—8F细胞各以2～2．5×105个／孑L的密度接种