应用rnai抑制食管癌细胞端粒酶活性的实验研究

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1、应用RNAi抑制食管癌细胞端粒酶活性的实验研究作者：彭彦辉王亮陈卫云郝玉宾邢邯英【摘要】目的研究载体介导RNA干扰技术(RNAi)对人食管癌细胞株ECA109端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)表达及端粒酶活性的抑制作用。方法设计并构建3条hTERT基因的siRNA序列干扰质粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及对照质粒，并将其分别转染ECA109食管癌细胞,应用RTPCR法观察各转染细胞hTERTmRNA表达水平的改变，末端重复片段扩增酶联免疫吸附(TRAPELISA)方法测定细胞端粒酶活性。结果与对照质粒比较，转染24h后

2、，干扰质粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组细胞端粒酶活性均显著下降(P<0.01);转染48h后,各干扰质粒的抑制率依次为49%、79%、53%。干扰质粒转染ECA109细胞中hTERTmRNA的表达较对照质粒转染ECA109细胞中hTERTmRNA的表达量显著下降，仅为对照组的55.4%。结论成功构建载体介导的hTERT靶向RNA干扰重组体，能有效抑制ECA109细胞端粒酶活性及hTERTmRNA的表达。【关键词】RNA干扰;食管癌;人端粒酶逆转录酶;端粒酶　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofRNAinterference(RNA

3、i)ontheexpressionofhumantelomerase10reversetranscriptase(hTERT)andtheactivityoftelomerase.MethodsAccordingtothenucleotidesequenceofhTERTingenebankandreferringtothedesignstrategiesofsiRNA,mRNAinterferingdoublestrandedDNAvectorⅠ，Ⅱ，Ⅲandthecontrolvectorwereconstructedrespectivelyandthenweret

4、ransfectedintotheECA109cells.TheexpressionsofhTERTofthetransfectedcellsweredeterminedbyRTPCRandtheactivityoftelomerasewasdeterminedbytelomericrepeatamplificationELISA(TRAPELISA).ResultsComparedwiththecontrolvectorgroup,thetelomeraseactivationofECA109cellsininterferingvectorⅠ，Ⅱ，Ⅲgroupwe

5、reloweraftertransfectedfor24and48h(P<0.01).TRAPELISAresultsshowedthattheinhibitionrateofinterferingvectorⅠ，Ⅱ，Ⅲonthetelomeraseactivationwere49%，79%，53%respectivelyandthemaximuminhibitionratewasinterferingvectorⅡ.InterferingvectorⅡalsodeclinedthemRNAexpressionlevelofhTERTgeneinECA109cel

6、lsascomparedwiththecontrolgroup.ConclusionsThesiRNAexpressionplasmidwassuccessfullyconstructedandcouldinhibittheexpressionofhTERTmRNAandtelomeraseactivity,whichmaybebeneficialinsearchingfornewgenetherapyofthetumors.10　　【Keywords】RNAinterference;Esophagealcarcinoma;Humantelomerasereverset

7、ranscriptase;Telomerase　近年研究证实肿瘤组织中端粒酶阳性率高达85%以上,人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤〔1〕。抑制其表达可有效地抑制肿瘤细胞的生长和诱导凋亡，目前已成为肿瘤基因治疗的理想靶标。RNA干扰(RNAi)作为一种简单有效的代替基因敲除的工具正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命。本研究拟选择hTERT基因作为研究靶点，运用体外转录法合成多对小干扰RNA(siRNA),转染人食管癌细胞，检测