应用rnai抑制食管癌细胞端粒酶活性的实验研究

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1、应用RNAi抑制食管癌细胞端粒酶活性的实验研究作者：彭彦辉王亮陈卫云郝玉宾邢邯英【摘要】目的研究载体介导RNA干扰技术(RNAi)对人食管癌细胞株ECA109端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)表达及端粒酶活性的抑制作用。方法设计并构建3条hTERT基因的siRNA序列干扰质粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及对照质粒，并将其分别转染ECA109食管癌细胞,应用RTPCR法观察各转染细胞hTERTmRNA表达水平的改变，末端重复片段扩增酶联免疫吸附(TRAPELISA)方法测定细胞端粒酶活性。结果与对照质粒比较，转染24h后，

2、干扰质粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组细胞端粒酶活性均显著下降(P<0.01);转染48h后,各干扰质粒的抑制率依次为49%、79%、53%。干扰质粒转染ECA109细胞中hTERTmRNA的表达较对照质粒转染ECA109细胞中hTERTmRNA的表达量显著下降，仅为对照组的55.4%。结论成功构建载体介导的hTERT靶向RNA干扰重组体，能有效抑制ECA109细胞端粒酶活性及hTERTmRNA的表达。【关键词】RNA干扰;食管癌;人端粒酶逆转录酶;端粒酶　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofRNAinterference(RNAi)

3、ontheexpressionofhumantelomerasereversetranscriptase(hTERT)andtheactivityoftelomerase.MethodsAccordingtothenucleotidesequenceofhTERTingenebankandreferringtothedesignstrategiesofsiRNA,mRNAinterferingdoublestrandedDNAvectorⅠ，Ⅱ，ⅢandthecontrolvectorinedbyRTPCRandtheactivityoftelomeraseinedby

4、telomericrepeatamplificationELISA(TRAPELISA).ResultsparederaseactivationofECA109cellsininterferingvectorⅠ，Ⅱ，ⅢgrouperaseactivationaximuminhibitionrateRNAexpressionlevelofhTERTgeneinECA109cellsasparedidRNAandtelomeraseactivity,aybebeneficialinsearchingforneors.　　【Keya;Humantelomeraserevers

5、etranscriptase;Telomerase　近年研究证实肿瘤组织中端粒酶阳性率高达85%以上,人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤〔1〕。抑制其表达可有效地抑制肿瘤细胞的生长和诱导凋亡，目前已成为肿瘤基因治疗的理想靶标。RNA干扰(RNAi)作为一种简单有效的代替基因敲除的工具正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命。本研究拟选择hTERT基因作为研究靶点，运用体外转录法合成多对小干扰RNA(siRNA),转染人食管癌细胞，检测其对端粒酶活性的抑制，筛选出高效抑制端粒酶活

6、性的siRNA，为开发抗肿瘤新药和基因治疗提供实验和理论依据。　　1材料与方法　　1.1材料人食管癌细胞株ECA109购自北京大学医学部肿瘤研究所;端粒酶试剂盒购自Roche公司;质粒纯化试剂盒购自Qiagen公司;LipofectamineTM2000为Invitrogen产品;KCsiRNATM试剂盒购自上海康成生物工程公司。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养ECA109细胞用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基置于5%CO2，37℃的饱和湿度培养箱中培养，每3天传代一次。　　1.2.2载体构建质粒图谱见图1。根据基因文库中报道的hTERT的核苷酸序列(序列号：B

7、C062321)，参考siRNA的设计策略，通过基因blast，挑选3条目的hTERT基因的siRNA序列：Ⅰ(563～581)：TTGCAAAGCATTGGAATCA;Ⅱ(740～757)：AGAACGTTCCGCAGAGAA;Ⅲ(1657～1676)：GTACAGGTTTCACGCATGT。对于每个选定的siRNA序列，设计合成两条siRNA的DNA模板单链。模板链包括siRNA的正义链与反义链，中间以9个脱氧核苷酸“形成的环”结构相连，后面接有RNAPolyⅢ聚合酶转录终止位点，同时模板两端分别设计BamHⅠ