pinx1基因联合顺铂调控鼻咽癌细胞端粒酶活性、抑制增殖迁移实验的研究

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1、硕士学位论文PinXl基因联合顺铂调控鼻咽癌细胞端粒酶活性、抑制增殖迁移的实验研究研究背景硕士研究生：杨柯柯指导老师：文忠教授摘要鼻咽癌(NasopharyngealcarcinomaNPC)是我国南方地区高发的一种恶性肿瘤(发病率每年在10．150／1001000)，也是头颈部常见的恶性肿瘤之一，治疗上以放疗或辅助诱导化疗加放疗为主，但放化疗导致的局部及全身后遗症严重影响了患者的生存质量。并且，由于鼻咽癌的发病部位较为隐蔽，首诊时多数患者已经伴有淋巴结侵袭或和远处转移，因此，同步放化疗成为局部晚期鼻咽癌患者治疗的标准方式。但有报道化疗耐药占到恶性肿瘤约75％左右，

2、成为鼻咽癌治疗失败，出现复发、转移、影响总体生存率的因素之一。目前，肿瘤多药耐药的机制还不清楚，如何逆转耐药提高治疗效果成为鼻咽癌治疗领域亟待解决的问题。肿瘤细胞的多药耐药性(multidrugresistanceMDR)是指细胞对结构和功能均不同的化疗药物产生的耐药性，分为原发性和获得性耐药，后者较为常见。研究MDR的分子机制，对于提高鼻咽癌患者的生存率，减少复发及转移极其重要。一些研究表明，端粒长度／端粒酶活性参与肿瘤MDR。我们课题组曾较为系统探讨了端粒酶在鼻咽癌发病中的作用，发现端粒酶在鼻咽癌细胞及鼻咽癌CDl33+干细胞中高表达，靶向降低端粒酶活性可以明显

3、抑制鼻咽癌细胞增殖及迁移。PinXl基因是近年在人和酵母菌细胞中发现的一个能与端粒／端粒酶相互作中文摘要用的保守核仁蛋白，是端粒酶结合蛋白pin2／TRFl相互作用的一种结合蛋白，并且是唯一能直接与端粒酶结合的一种端粒结合蛋白，高表达PinXl的C．端片段能显著抑制细胞端粒酶活性，缩短端粒并抑制端粒酶阳性肿瘤细胞在体内外生长，被有些学者认为是一种内源性的端粒酶抑制剂，我们的前期研究也证实了PinXl能降低鼻咽癌细胞株的端粒酶活性，并促进该肿瘤细胞凋亡的产生。在一系列前期研究工作的基础上，本研究拟观察PinXl基因在鼻咽癌细胞化疗增敏、逆转化疗耐药中的作用，并进一步探

4、讨端粒酶、抗凋亡因子Bcl2及耐药相关基因LRP在这一过程中的调控作用。研究目的观察PinXl基因联合顺铂对人鼻咽癌细胞生物学特性的影响，为基因联合化疗减低鼻咽癌化疗抵抗提供理论依据；探讨端粒酶活性改变、抗凋亡基因Bcl．2及肺耐药相关基因LRP对在上述过程的调节作用。研究内容和方法1、重组慢病毒的构建及鉴定将含PinXl的质粒连接到慢病毒穿梭载体上，并经双酶切及测序鉴定确认，与另外两种辅助质粒共转染293T细胞，收集并浓缩重组病毒液，用浓度梯度法计算病毒滴度。2、慢病毒感染鼻咽癌细胞、检测感染前后PinXl的变化分别将慢病毒Lenti．PinXl和对照组慢病毒Le

5、nti．Crtl感染过的鼻咽癌细胞命名为Lenti．PinXl．5．8F、Lenti．Crtl．5．8F细胞。并用荧光定量PCR检测Lenti．PinXl．5．8F、Lenti．Crtl．5．8F和5．8F细胞中基因mRNA的表达，Westernblotting检测PinXl蛋白的表达。3、PinXl联合顺铂对鼻咽癌细胞株生物学特性的影响1)用MTT法检测不同处理组鼻咽癌细胞株的体外增殖能力对感染前后的鼻咽癌细胞5—8F和Lenti．PinXl．5．8F加入不同浓度顺铂处理II硕士学位论文后，酶标仪测570nm处的吸光度即OD(570)值，每组设置5个复孔，取各复孔

6、的平均值为各组结果。然后，计算生长抑制率，绘制生长抑制曲线，并据Q=E(A+B)／(EA+EB．EA*EB)计算PinXl与化疗药问的相互作用。2)Hoechst33258染色对细胞的凋亡进行形态学观察分别将Lenti．PinXl．5．8F和5．8F以lx104／ml、500ul／孔接种到24孔板中．培养12h待细胞贴壁后，PBS洗细胞两次，按实验分组分别加入500ul全培稀释的顺铂(16ug／m1)或完全培养基，继续置于37"C，5％C02培养箱培养48h后，4％多聚甲醛室温固定细胞、lug／ml的Hoechst33258染色，荧光显微镜下观察细胞形态变化。3)流

7、式细胞仪检测细胞周期收集对数生长期的Lenti．PinXl．5．8F和5．8F细胞，PBS洗涤、重悬，调整细胞浓度为lxl06／ml，取lml细胞悬液；1000rpm离心5min，弃上清；加入4℃预冷70％乙醇固定，经PBS洗涤，加入lOOulRnaseA37℃水浴30min；避光加入400ulPI染液4"C避光染色至少30min；流式细胞仪上机检测4)Transwell小室检测不同处理后鼻咽癌细胞的迁移能力将Lenti．PinXl．5．8F和5．8F细胞接种到24孔板中，待细胞贴壁后分别给予全培稀释的16ug／ml顺铂或全培继续培养48小时，PBS洗涤细胞，胰