基于c-met基因沉默联合化疗抑制结肠癌细胞增殖、迁移的研究

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。研究生签名．勰导师签章告俸二级学河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写

2、的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：南名导师签章：刍后矽，弓年弓月侈El目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文基于c．Met基因沉默联合化疗抑制结肠癌细胞增殖、迁移的研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7日U吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’／材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·20附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·23讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·28结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·30参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·31综述c．Met靶向抑制联合放化疗与结直肠癌的治疗⋯⋯⋯⋯⋯⋯35致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·46个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·47中文摘要基于c．Met基因沉默联合化疗抑制结

4、肠癌细胞增殖、迁移的研究摘要结直肠癌是全世界发病率排名第三的恶性肿瘤，每年有超过100万患者确诊为结直肠癌，且约有60万人死于结直肠癌，其总的5年生存率仅为50．70％。结直肠癌主要通过脉管方式(淋巴管和血管)向远处转移，部分患者在就诊时已出现淋巴结及血管转移，这些结直肠癌患者的预后较差。早、中期结直肠癌的治疗手段仍然以手术治疗为主，而中、晚期结直肠癌则以放化疗为基础联合靶向药物治疗为主要手段。目前以血管内皮生长因子(ⅦGF)和表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的两类靶向药物在结直肠癌临床治疗中得到了广泛的应用，并取得了

5、可喜的效果，但是原发性或继发性耐药的问题严重影响了靶向药物的临床疗效。c．Met是由原癌基因c．met编码的是一类重要的酪氨酸激酶受体，在结直肠癌细胞中过量表达，且与肿瘤增殖、迁移、侵袭、肿瘤血管形成及肝转移密切相关。其特异性配体为肝细胞生长因子／离散因子(HGF／sF)。临床证据显示，65％结肠癌原发灶或者转移灶组织中的C．Met的表达水平明显高于正常的结肠黏膜上皮组织，且外周血血清中和肿瘤组织中的HGF表达水平明显升高。这些证据提示了c．Met可以成为结直肠癌治疗的重要靶点，也使得对基于c．Met的分子靶向治疗联合传

6、统放化疗在结直肠癌上抗肿瘤活性和作用机制的探讨至关重要。在前期实验中我们采用慢病毒介导的可调控诱导小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)技术，在人结肠癌细胞SW620上建立稳定可调控细胞系，抑制c．met基因的表达。适当沉默c．Met后，SW620的增殖明显低于对照组。本实验则继续探讨：适当沉默c．Met后联合传统化疗对人结肠癌细胞SW620的增殖及迁移的影响。目的：将构建成功含有人c．Met基因可调控shRNA的重组质粒进行慢病毒包装，感染SW620细胞并筛选出稳定可调控诱导的细胞系。探讨适

7、当敲除c．Met后联合化疗对SW620细胞增殖、迁移的影响。中文摘要方法：1将pMDL、pRSV、VSVG辅助质粒及重组的pSD400．C．Met．shRNA质粒按一定比例混合，在Megatranl．0介导下，共转染293T细胞进行病毒包装，收集病毒液并感染SW620细胞，利用嘌呤霉素(puromycin)筛选出稳定表达针对c．met的shRNA的细胞株。2用多西环素(Doxycycline)诱导稳定细胞系，用Westem．blot和免疫荧光的方法，在蛋白水平检测稳定可调控细胞系c．Met的表达量。3利用Transwel

8、I的方法，检测适当敲低c．Met后SW620细胞的迁移能力。4利用alamar-Blue和Colonyformation的方法，检测c．Met敲低后联合化疗药对SW620细胞增殖的抑制。结果：1用质粒共转染293T进行慢病毒包装，收集48小时的病毒感染SW620细胞24小时，加嘌呤霉素筛选一周，然后将形成的单克隆扩大