维甲酸联合胆汁酸对结肠癌细胞增殖、抑制凋亡的影响及初步机制研究

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1、维甲酸联合胆汁酸对结肠癌细胞增殖、抑制凋亡的影响及初步机制研究[摘要]目的探讨维甲酸联合胆汁酸对结肠癌细胞增殖、抑制凋亡的影响及初步机制。方法选用不同浓度的维甲酸及脱氧胆酸钠，分别或联合作用于人结肠腺癌HT-29细胞，检测细胞的增殖以及抑制凋亡情况。结果维甲酸联合胆汁酸可以有效抑制HT-29细胞的生长，诱导细胞凋亡，效果优于单独应用（P<0.05）。结论维甲酸联合胆汁酸能够抑制结肠癌细胞增殖，且抑制凋亡的程度与浓度相关，能够为结肠癌的治疗提供参考。中国6/vie　　[关键词]维甲酸；胆汁酸；结肠癌；细胞增殖；抑

2、制凋亡　　[中图分类号]R735.35[文献标识码]A[]1673-9701（2017）01-0008-03　　结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率在我国仅次于胃癌和食道癌，居消化道恶性肿瘤的第3位。随着我国居民生活质量以及饮食结构的变化，结肠癌的临床发病率越来越高。肠腔内部微环境的变化同结肠癌发病之间的联系受到人们的重视，并且研究人员发现该病的发生发展同动物脂肪的摄入存在联系，推测原因是高脂饮食会加大肠腔内部的脱氧胆酸，脱氧胆酸作为胆汁酸的一种，能够通过诱发细胞DNA的损伤而诱导结肠癌出现[1]。维甲酸（A

3、TRA）有着广泛抗肿瘤增殖的活性，能够降低结肠癌细胞的耐药性，不过大剂量使用的毒副作用较为明显，这就需要探索联合用药抑制细胞增殖的小剂量ATRA。本研究分析ATRA联合胆汁酸脱氧胆酸对结肠癌细胞增殖以及凋亡的影响，探讨其可能的作用机制，现报道如下。　　1资料与方法　　1.1一般资料　　结肠癌细胞株为STT为Promaga公司生产，小牛血清为杭州四季清公司生产，脱氧胆酸为上海华美公司生产，兔抗人COX-2抗体为Neomarkers公司生产，ATRA为sigma公司生产，酶标仪型号为Elx800。　　1.2方法　　

4、1.2.1细胞培养以及药物准备肿瘤细胞在培养时选用胎牛血清培养液，条件设置方面，温度37℃，CO25%，湿度100%，培养细胞1d到对数生长期，在弱光条件下换液后进行实验[2]。使用100mg的ATRA加入乙醇当中配成10mmol/L的母液，在-20℃条件下避光储存。实验所需要的ATRA使用培养液进行稀释，且全部实验均需要重复3次进行细胞培养。HT-29细胞培养使用RPMI-1640溶液，添加胎牛血清、链霉素以及青霉素，37℃条件下传代培养，每天观察细胞的生长状况[3]。　　1.2.2MTT实验取对数生长期HT

5、-29细胞接种到96孔板，每孔10000。细胞贴壁1d之后按组别添加浓度10、50、100μmol/L的ATRA，每孔20μL，每组共5个复孔，持续培养24h、48h或72h，在反应终止前吸去培养液，并加入RPMI-1640培养基，孵箱内3h之后弃上清，使用异丙醇100μL溶解结晶振荡10min之后应用酶标仪读取值[4]。　　1.2.3细胞周期以及细胞凋亡HT-29细胞根据5×105/mL接种到6空板，每孔3mL，1d之后按组别加入不同浓度的脱氧胆酸，每孔3mL，每组设置5个复孔。作用1d之后收集贴壁以及悬浮的

6、细胞，根据说明书使用细胞仪进行检测[5]。　　1.2.4免疫细胞染色HT-29细胞根据5×105/mL接种到6空板，每孔3mL，在1d之后分别加入不同浓度的脱氧胆酸，每组设置3个复孔。作用1d之后终止反应并吸去培养液。使用冷丙酮进行10min固定，PBS反复进行3次冲洗，滴加100μL的兔抗人COX-2抗体，5℃冰箱储存，第2天使用PBS反复进行3次冲洗，滴加100μL羊抗兔IgG-HRP，并37℃孵育1h，PBS反复进行3次冲洗之后DAB显色，脱水，透明，使用树胶封片[6]。　　1.3判断标准　　结果判定方面

7、，COX-2及caspase-3染色定位到细胞质。PARP-1染色定位到细胞核，其中阳性物质为棕黄色或黄色的颗粒。每张玻片选取3个视野（×400），每个视野统计100个细胞，由病理科医师使用相关软件来测定三者的密度值之后取均值[7]。　　1.4统计学方法　　检测数据用SPSS18.0软件进行分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1不同浓度/时间ATRA对结肠癌细胞增殖的抑制率　　不同浓度/时间的ATRA对于细胞增殖有明显的抑制作用，8μmol/

8、L的ATRA在作用72h之后对肿瘤细胞的抑制效果显著优于24h以及48h（P<0.05），见表1。　　2.2ATRA联合脱氧胆酸对HT-29细胞周期和细胞凋亡的影响　　流式细胞仪的分析结果表明，10μmol/L的脱氧胆酸联合8μmol/L的ATRA作用HT-29细胞24h，能够增加HT-29细胞的凋亡，同时细胞周期阻滞在G0/G1期，并且S期细胞明显减少（P<0.05），见表2。　　2