pnptk融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

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1、PNPTK融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究作者：周俊立,蔡晓坤杨翌周卫平,王德全姚振江【摘要】目的分析PNPTK融合自杀基因系统对HepG2肝癌细胞的杀伤作用及其对肝癌细胞的杀伤机制。方法利用重组PCR定点诱变法制备PNPTK融合基因，将其插入真核表达载体pcDNA3.0中，构建融合基因表达载体pcDNA3.0/PNPTK，经酶切、PCR及测序鉴定重组体，G418筛选获得稳定转染了pcDNA3.0/PNPTK的抗性细胞克隆。RTPCR和TT法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致

2、的旁观者效应。结果融合基因片段PNPTK正确插入了pcDNA3.0载体中，pcDNA3.0/PNPTK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。细胞抗性克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下，pcDNA3.0/PNPTK对肝癌细胞产生了良好的旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3.0/PNPTK对肝癌细胞HepG2有着良好的杀伤作用，有望将其应用于肝癌体内治疗。【关键词】PNPTK融合基因;肝癌;基因治疗　Abstract:ObjectiveToinvestigatethecytotoxice

3、ffectsofaPNPTKchimericgeneonthebasisofPNPsuicidegeneonHepG2hepatomacellsandexplorethepotentialmechanismofthEirkillingeffects.MethodsAfusionsuicidegene,PNPTK,utagenesistechnique.Andthenitericgene,pcDNA3.0/PNPTK.Therebinante,PCRandsequencing.Thenitemediatedmethod

4、.Thecellularclonestablytransfectedethod.Thegroinedbytrypanblueexclusiontest.Thesensitivityofthecellclonetoitscorrespondingprodrugsandthecausedbystandereffectsethod.ResultsThePNPTKfusiongeneed.ThecellularcloneonstratedthatthebystandereffectsderivedfrompcDNA3.0/PNP

5、TKafterthesynergetictreatmentofMePdRandGCVighty.ConclusionThekillingeffectsofthebifunctionalsuicidegenevector,pcDNA3.0/PNPTK,onhepatomacellsaresatisfactory.ItisingtoapplypcDNA3.0/PNPTKtogenetherapyforhepatomainvivo.　　Keyericgene;Hepatoma;Genetherapy　　单自杀基因系统治疗肿

6、瘤易引起肿瘤耐药性，又存在着对特定细胞类型的依赖性。融合自杀基因产物兼具两种自杀基因的功能，使两种自杀基因产生协同作用，从而既克服了细胞类型依赖性，又减少了肿瘤细胞对药物的耐药性，提高了这一疗法的实用性。本实验将一种新型自杀基因系统——大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)/6甲基嘌呤脱氧核糖核苷(MePdR)系统[1]与目前已广泛应用的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(MePdR)/GCV[2]系统相结合，构建融合自杀基因表达载体pcDNA3.0/PNPTK，筛选出稳定表达PNPTK基因的抗性细胞克隆，经旁观者效应证实融

7、合自杀基因PNPTK对于肝癌细胞的杀伤作用。结果显示，在两种前药协同作用的情况下，pcDNA3.0/PNPTK对肝癌细胞显示出良好的杀伤作用。　　1材料　　1.1细胞株肝癌细胞株HepG2购自武汉中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。　　1.2质粒与菌株真核表达载体pcDNA3.0购自Invitrogen公司，携PNP基因质粒pTyrPNP2美国Pittsburgh大学DavidBarlett教授惠赠，含MePdR基因载体pⅡ1.5tk由美国Emory大学ChiaLingHsieh教授赠送。大肠杆菌DH5α菌株由

8、本所保存。　　1.3主要试剂与药品实验所用限制性内切酶、T4DNA连接酶、高保真Taq酶、DNA片段回收试剂盒以及质粒纯化试剂盒均购自Takara公司。G418、胎牛血清、DMEM培养基、MePdR购自GIB/BRL公司;总RNA提取试剂盒Trizol、脂质体Lipofectamine2