双自杀基因系统对结肠癌细胞靶向杀伤作用实验研究

《双自杀基因系统对结肠癌细胞靶向杀伤作用实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、双自杀基因系统对结肠癌细胞靶向杀伤作用实验研究【摘要】目的：研究观察腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统（以下简称AdKDR-CDglyTK）对结肠癌的治疗作用并进行作用机理分析。方法:采用将人结肠癌细胞系SW620、LS174T移植接种于裸鼠腋下，建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型。将20只裸鼠每组五只随机分为四组。1组：注射重组腺病毒AdKDR-CDglyTK与前药5-FC和GCV；2组：注射前药5・FC和GCV；3组:注射重组腺病毒AdKDR-CDglyTK；4组：对照组。瘤体内多点注射重组腺病毒AdK

2、DR-CDglyTK,5-FC和GCV采用腹腔内注射，观察各组裸鼠的状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤牛长抑制率、常规病理等指标；电镜观察细胞的超微结构，用TUNEL法检测细胞凋亡率，比较观察各治疗组的疗效；对各组的肿瘤组织行RT-PCR的检测，了解有无双自杀基因CDglyTK的表达。结果：第1组裸鼠移植瘤的生长显著受到抑制，第2、3、4组肿瘤生长情况无明显差别。第1组肿瘤细胞凋亡指数较对照组显著增加（P二0.00）。结论AdKDR-CDglyTK联合前药5-FC和GCV对人结肠癌SW620、LS174T细胞具有明显的靶向抑

3、制作用，并可诱导裸鼠体内人结肠癌SW620、LS174T细胞凋亡。【关键词】结肠肿瘤；自杀基因；裸鼠；细胞凋亡【中图分类号】R735.35【文献标识码］A【文章编号】1004-6194（2015）02-0427-02近年来，结肠癌的病例逐渐增多，治疗效果也不理想，尤其是手术后复发常常困扰着广大医务人员。随着分子牛物学及基因工程的迅速发展，基因治疗己成为恶性肿瘤的有效治疗手段之一，在众多的基因治疗方法中，自杀基因疗法成为近年基因治疗的研究热点［1-3］o自杀基因疗法是一种酶前药系统，即一些非哺乳动物基因表达的酶能将无毒

4、或低毒的前药在宿主体内转换成有毒的化学物质，杀伤肿瘤细胞，自杀基因还能通过“旁观者效应”扩大杀伤范围，并可先转染后治疗及诱导免疫等特点从而达到更好的治疗效果。木研究旨在探讨AdKDR-CDglyTK联合前药5-FC和GCV对结肠癌的治疗作用，以及该体系能否诱导体内结肠癌细胞的凋亡。证实其有效性，并探讨其作用机理，为结肠癌的基因治疗提供新思路和实验证据。1材料、方法1.1实验材料重组腺病毒AdKDR-CDglyTK,293细胞，SW620、LS174T细胞。RPMIJ640、小牛血清、、PBS,GCV,5-FCoTri

5、zolReagent试剂盒。CD-TK引物为：上游引物5'・AGGCTAACAGTGTCGAATAACGCT-3-下游引物:57-GTTAGCCTCCCCCATCTC-3'。SPFBalb/c裸鼠,4・6周龄，雌性。1.2实验方法121重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定与鉴定见参考文献［4］。122人结肠癌细胞SW620、LS174T培养。10%小牛血清的1640培养。37°C,5%二氧化碳孵箱培养，80%细胞融合按照1：2传代。1.2.3重组腺病毒对SW620、LS174T细胞转染效率测定：2×105个细胞

6、接种于6孔培养板，细胞丰度达约90%时，加入不同感染复数(multiplicityofinfection,MOI)的目的腺病毒继续培养，3d后在荧光显微镜下计数绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞的百分比。1.2.4裸鼠移植瘤模型建立、治疗：10%小牛血清RPMI-1640培养SW620>LS174T细胞，收集对数生长期的SW620、LS174T细胞，lOOOrpm离心后，在无血清RPMI-1640重悬，调节浓度，取细胞悬液0.1ml,细胞数1.0×107,接种SW620、LS174T细胞1.0×1

7、07/个于小鼠腋下，肿瘤直径达到0.5cm吋，随机分4组，每组5只。1组:注射重组腺病毒AdKDR-CDglyTK与前药5-FC和GCV；2组：注射前药5・FC和GCV；3组:注射重组腺病SAdKDR-CDglyTK；4组：空H对照。1组和3组瘤体内多点注射腺病毒，2次/周，共两周；第1次腺病毒注射24h后，1组于裸鼠腹腔内注射GCV(50mg/kg·d)>5-FC(500mg/kg·d),连用14d；2组同时、同样、同量给药。瘤体内注射后每3d分别测量各组瘤体人小，计算方法：瘤体体积=a

8、×b2/2mm3(a二长径，b二短径）计算瘤体体积及生长曲线；治疗结束后，处死裸鼠，取0.1mm3的肿瘤组织电镜观察。抑瘤率二（对照组平均瘤质量一治疗组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量，制作石蜡切片常规病理和免疫组化检查。125肿瘤组织常规病理变化观察，免疫组化检测、细胞凋亡测定。肿瘤标本称重后，常规固定、包埋、切片，HE染色观察。用