双自杀基因cdtk载体系统对人视网膜母细胞瘤y79细胞体外杀伤作用的研究

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1、双自杀基因CDTK载体系统对人视网膜母细胞瘤Y79细胞体外杀伤作用的研究【摘要】目的：研究肿瘤特异性双自杀基因载体pcChCDTK对人视网膜母细胞瘤Y79细胞的体外杀伤作用。方法：将双自杀基因载体pcChCDTK电转染Y79细胞株。通过RTPCR和Westernblot方法确定CDTK在体外培养的细胞中表达情况。用HPLC法测定转染Y79细胞中5FC向5FU的转化效率。向载体转染和未转染的Y79细胞中加入不同浓度的前体药物5FC(0，25，50，100，200，400，800mg/L)和/或GCV(0，2，4，8，16，32，64mg/L

2、),5d后用MTT法检测Y79细胞的平均存活率。结果：双自杀基因载体pcChCDTK电转染Y79细胞成功：在载体转染的Y79细胞中，RTPCR扩增出长度为403bp的特异条带，Westernblot检测见一59kD大小的条带，与CDTK基因序列分析的预期结果一致。双自杀基因载体系统致Y79细胞存活率降低：转染Y79细胞中，5FC向5FU转化的效率为84.5%。转染和未转染Y79细胞中加入5FC或GCV后平均细胞存活率均随浓度增加而降低，两组比较当5FC浓度达到100mg/L,GCV浓度达到8mg/L后各对应浓度组间均存在差异(P<0

3、.05)。转染组间比较，当5FC达200mg/L,GCV达16mg/L后，5FC+GCV组平均细胞存活率低于单加5FC或GCV组，有统计学差异(P<0.05)。结论：双自杀基因载体pcChCDTK转染Y79细胞后，在Y79细胞被转录和翻译成CDTK双自杀基因蛋白。给予515FC和GCV达到一定浓度时，它们转化成细胞毒性物质对Y79细胞产生杀伤作用。双前体药物的杀伤作用大于单前体药物。【关键词】CDTK基因;视网膜母细胞瘤;自杀基因治疗;5FC;GCV　　Abstract　　AIM:Toinvestigatethekillingef

4、fectsoftumorcellsspecificvectorofsuicidegeneofCDglyTKdrivenbyhTERTpromoteronretinoblastomaY79cellsinvitro.　　METHODS:Atfirst,therecombinantplasmidwastransferedintoY79cellswithelectroblotasadeliverysystem.RTPCRandWesternblotanalysiswereusedtodeterminetheCDTKmRNAandproteinexpres

5、sioninY79cellswhichhadbeentransfectedbypcDNA3.1CMVhTERTCDTKplasmidvector.Theconversionefficiencyof5FCinto5FUinCDglyTKexpressingY79cellswasmeasuredbyHPLC.ThekillingeffectsofdoublesuicidegenesonY79cellsthattreatedwith5FC,GCVofdifferentconcentrationsweredeterminedbythemetho

6、dofMTT.15　　RESULTS:TheexpressionofCDTKgeneinY79cellswascertificatedbyRTPCRandWesternblotanda59kDproteinwasobtaindwhichwasequaltothesequenceexpectionofCDTKgene.InMTTanalysis,therewassignificantdifferencebetweentransfectedandnontransfectedsurvivalY79cells(P<0.05).Thesurviva

7、lY79cellstreatedwith5FCandGCVwaslowerthan5FCorGCV.　　CONCLUSION:TherecombinantplasmidvectorpcDNA3.1CMVhTERTCDTKcanbetranscribedandtranslatedintoCDTKfusionproteininY79cells.ThetransferoftheCDglyTKfusiongeneintoY79cellsfollowedbytheadministrationof5FCorGCVcankillY79cellsinv

8、itro.Thekillingeffectoftwopredrugsisstrongerthanthatof