ny-eso-1致敏树突状细胞诱导的ctl杀伤视网膜母细胞瘤细胞株作用的研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文NY--ESO--1致敏树突状细胞诱导的CTL杀伤视网膜母细胞瘤细胞株作用的研究姓名：周学智申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：周希瑗201205NY—ESO-1致敏树突状细胞诱导的CTL特异性杀伤视网膜母细胞瘤细胞株作用的研究摘要研究目的：本文通过肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1致敏树突状细胞，诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞对视网膜母细胞瘤细胞株HXO—RB44的杀伤作用效果。研究方法：1．自行构建NY—ESO一1基因的重组质粒pDC316／NY—ESO一1，并鉴定其在真核细胞中的表达。2．Ficoll法分离人血获得单个核细胞，通过rhGM—CSF和r

2、hlL一4诱导培养外周血来源的DCs，重组质粒转染DCs，LPS诱导DCs成熟，成熟DCs刺激特异性CTL细胞增殖。CTL特异性杀伤HXO-RB44细胞株，通过MTT法检测CTL的增殖以及CTL对视网膜母细胞瘤细胞的杀伤作用。研究结果：1．经过检测重组载体pDC316／NY—ESO-1的目的片段序列与原基因序列完全相同，酶切鉴定结果与预期一致。2．在细胞株HXO—RB44中可以检测到NY—ESO一1基因的表达，Western-blot法和免疫荧光可检测到NY-ESO-1基因较为强烈的表达。3．经rh6M—CSF和rhIL一4成功诱导出的外周血DCs，脂质体介导’重组质粒pDC

3、316／NY—ESO-1转染诱导成熟的DCs，通过流式细胞技术检测到转染后DCs表型分子分别是HLA—DR为42．1％，CDSO为54．2％，CD83为39．7％，CD86为94．8％。转染后DCs刺激产生的CTL组的增殖能力强于未经过转染DCs刺激产生的CTL组。4．通过将转染后DCs诱导的CTL，未转染DCs诱导的CTL和无DCs的淋巴细胞三组分别同细胞株HXO—RB44进行联合培养，检测到转染后DCG刺激产生的CTL对视网膜母细胞瘤细胞株的杀伤效果显著高于未经处理DCs刺激产生的CTL组和无DCs组，且效靶比为75：l(P(O．05)时杀伤率最强。结论：本实验检测到NY

4、—ESO一1基因在细胞株HXO-RB44中较为强烈的表达，NY—ESO—l在cT抗原中是最能引起体液和细胞免疫反应的抗原，并且也是最具免疫原性的肿瘤抗原之一，通过NY—ESO一1重组质粒构建，脂质体介导重组质粒转染Des诱导的特异性c1、L产生，而此种CTL对细胞株HXO-RB44具有特异性杀伤作用，为RB免疫治疗提出了一条新的方向，然而此种方法处于探索性研究阶段，尚需进一步深入研究。关键词：视网膜母细胞瘤；树突状细胞；细胞毒性T淋巴细胞；NY—ESO-1脬ESo-1PoSrI'IⅦ小MAN腿T矾oBIAsT伽雌CELLⅥ，ASKⅡjLEDBYNY．ESo．1-IMPIIⅡ．

5、SEDDENDRⅡ’ICPresentstudywastodiscusstheantigenspecificanti—tumoreffectofcytotoxicTlymphocyte(CTL)，whichinducedbycancertestisantigenNY-ESO-1-impulseddendriticcells(DCs)，againsthumanretinoblastoma(RB)1．WeconstructedatypeofpDC316／NY-ESO-1recombinantplasmid，atthesametime，itsexpressionwasdetecte

6、dmculturedeukaryocyte．2．Peripheralbloodmononuctearcells(PBMC)wasseperatedfrom60mlperipheralbloodofhealthydonorbyFicolldensity-gradientcentrifugation．DCswereinducedwithintedeukin一4(IL-4)andgranulocyte／macrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF)fromhumanPBMC．TherecombinantplasmidpDC316／NY-ESO·

7、1wastransfectedintoDCs．ThenthiskindofDCswereCO-culturewithTlymphocytes，andtheresultantCTLswasincreased．43．HXO-RB44celllineswasspeciallykilledbyCTLs．TheproliferationoftheCTLandtheeffectofthekillingtumorcellweretestbyMTT．Result：1．ThesequenceoftheclonedDNAf