致敏树突状细胞抗乳腺癌作用的实验研究

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果致敏树突状细胞抗乳腺癌作用的实验研究作者：黄宏思，黄卫彤，秦静英，黄衍强【摘要】目的探讨负载肿瘤抗原DC诱导的CTLs对乳腺癌细胞的杀伤作用。方法以负载肿瘤细胞抗原的DCs体外诱导CTLs，用ELISA法检测IFN-γ和IL-12的表达水平，用LDH法检测CTL对乳腺癌细胞的杀伤作用。结果负载肿瘤抗原DC组IFN-γ和IL-12的浓度高于未致敏DC组、抗原组及单核细胞对照组(P＜)，且负载

2、抗原DC组所刺激的CTLs的杀伤作用也强于未致敏DC组、抗原组及单个核细胞组(P＜)及对照的HT-29组(P＜)。结论采用乳腺癌细胞冻融抗原体外致敏DC，诱导产生肿瘤抗原特异性CTLs具有显著的抑瘤效应，实验证明致敏DC治疗乳腺癌是一种有效的方法，有望成为乳腺癌免疫治疗的新疗法。【关键词】乳腺癌；树突状细胞；细胞毒性T细胞乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女新发乳腺癌，占女性所有肿瘤的18%。乳腺癌总的5年生存率约50%～60%，近50%患者治疗后出现复发转移。晚期乳腺癌患者平均生存时间仅18～

3、30个月。人们一直在努力发展课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果新的治疗策略以降低乳腺癌的复发和转移，提高患者生活质量并尽可能延长乳腺癌患者的生存期［1］。生物治疗是近年来发展迅猛的又一重要治疗手段。目前的研究表明，树突状细胞激活的细胞毒性T淋巴细胞介导的免疫反应在机体抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用［2，3］。本研究

4、应用冻融法获取乳腺癌细胞抗原致敏DC，观察其诱导的CTLs对乳腺癌细胞的杀伤作用，探讨DC疫苗用于乳腺癌患者免疫治疗的可行性。　1材料　　人乳腺癌细胞株MCF-7、人结肠癌细胞株HT-29购自中国医学科学院肿瘤医院。rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a为美国Biosouce公司产品。人IL-12、IFN-γELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液购自天津灏扬生物公司。乳酸脱氢酶测试盒为美国Sigma公司产品。　2方法.1MCF-7人乳腺癌细胞冻融抗原的制备常规培养

5、MCF-7人乳腺癌细胞，收集并调整浓度为3×107个/ml快冻慢溶反复4次，000r/min离心20min后取上清液经微孔滤膜过滤作为肿瘤抗原，℃保存备用。.2树突状细胞的培养从健康者外周血中分离单个核细胞，培养获得贴壁的DC前体细胞，接种于96孔细胞培养板中培养，分为a、b、c组，其中a、b组均加入rhGM-CSF00课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生

6、提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果u/ml，rhIL-4的1000u/ml和TNF-α10ng/ml，c组不加任何细胞因子。至第3天只在a组中加入冻融法获取的肿瘤抗原50μl/ml。继续培养，第9天消化，分别收集3组细胞并计数。.3细胞毒性T淋巴细胞的体外诱导Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得健康者外周血PBMC，用自制的尼龙毛柱进行分离获取T淋巴细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2×105/ml。置于96孔培养板中，每孔1ml。分为A、B、C、D组:前3组分别加入上述收集的a、b、c组细胞，第4组加入冻

7、融抗原50μl，每组8个复孔。共同孵育d后，部分复孔进行杀伤活性的测定。剩余复孔细胞继续培养至第6天进行IFN-γ，IL-12的检测。.4CTLs对乳腺癌细胞的杀伤作用将MCF-7，HT-29细胞接种于96孔板中，均分为4组，分别加入以上A、B、C、D组CTL，每组3个复孔，同时设立与实验组对应的同浓度的效应细胞和靶细胞为对照，于培养箱中培养。2h后离心，取上清液100μl于mlEppen-dorf管中，按照试剂盒所示方法用乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。.5IFN-γ，IL-12的检测取上述体外诱导至第6天的CTLs细

8、胞上清液每孔100μl，按晶美公司ELISA检测试剂盒所示方法测定IFN-γ和IL-12含量。.6统计学方法实验数据用课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研