致敏树突状细胞抗乳腺癌作用的实验研究论文

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1、致敏树突状细胞抗乳腺癌作用的实验研究论文.freela公司产品。2方法2.1MCF-7人乳腺癌细胞冻融抗原的制备常规培养MCF-7人乳腺癌细胞，收集并调整浓度为3×107个/ml快冻慢溶反复4次，5000r/min离心20min后取上清液经微孔滤膜过滤作为肿瘤抗原，4℃保存备用。2.2树突状细胞的培养从健康者外周血中分离单个核细胞（PBMC），培养获得贴壁的DC前体细胞，接种于96孔细胞培养板中培养，分为a、b、c3组，其中a、b组均加入rhGM-CSF800u/ml，rhIL-4的1000u/ml和TNF-α10ng/ml，c组不加任何细胞因子。至第3天只在a组中加入冻

2、融法获取的肿瘤抗原50μl/ml。继续培养，第9天消化，分别收集3组细胞并计数。2.3细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的体外诱导Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得健康者外周血PBMC，用自制的尼龙毛柱进行分离获取T淋巴细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2×105/ml。置于96孔培养板中，每孔1ml。分为A、B、C、D4组:前3组分别加入上述收集的a、b、c组细胞（效应细胞与刺激细胞比为40：1），第4组（D组）加入冻融抗原50μl，每组8个复孔。共同孵育4d后，部分复孔进行杀伤活性的测定。剩余复孔细胞继续培养至第6天进行IFN-γ，IL-12的检测。2.4CTLs对

3、乳腺癌细胞的杀伤作用将MCF-7，HT-29细胞接种于96孔板中，均分为4组，分别加入以上A、B、C、D组CTL（效靶比40∶1），每组3个复孔，同时设立与实验组对应的同浓度的效应细胞和靶细胞为对照，于培养箱中培养。24h后离心，取上清液100μl于4mlEppen-dorf管中，按照试剂盒所示方法用乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。2.5IFN-γ，IL-12的检测取上述体外诱导至第6天的CTLs细胞上清液每孔100μl，按晶美公司ELISA检测试剂盒所示方法测定IFN-γ和IL-12含量。2.6统计学方法实验数据用±s表示，应用SPSS12.0统计软件统计分析。组间比较

4、采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。3结果3.1细胞因子IFN-γ和IL-12的检测乳腺癌细胞裂解物致敏后的DC与淋巴细胞一起培养，细胞因子IFN-γ和IL-12的含量比未致敏DC组、单纯乳腺癌细胞裂解物组和单个核细胞对照组高（P＜0.05）。表1细胞因子IFN-γ和IL-12的检测结果（略）3.2CTLs杀伤活性的检测肿瘤抗原致敏DC组诱导的CTLs对靶细胞的杀伤活性优于未致敏DC组及单核细胞组、单纯抗原组（P＜0.01）。且其对乳腺癌肿瘤细胞（MCF-7）的杀伤活性也明显优于对非乳腺癌肿瘤细胞（HT-29）的杀伤活性(P＜0.01)，见表2。说明肿瘤致敏DC诱

5、导的CTLs杀伤活性具有特异性。表2不同组CTLs对不同靶细胞的细胞毒活性（略）4讨论树突状细胞作为机体内免疫反应的始动子和调节子，在机体抗肿瘤免疫反应中极其重要，是近年来免疫学研究中最活跃的领域。在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给T细胞是导致免疫逃逸的重要原因。同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，特别是DC在数量和功能的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展［4］。利用成熟DC负载肿瘤抗原制备出高效DC疫苗，是目前研究的热点，也是能否诱导肿瘤特异性CTL产生的关健所在［5，6］。目前已研究出多种DC负载抗原的方法［7

6、］，其中冻融裂解法获得肿瘤全抗原，无需明确肿瘤抗原具体的抗原成分，而有多种不同肿瘤抗原成分同时刺激DC，诱导出针对不同抗原决定簇的特异性CTL，该法具有潜在的优势。从我们的检测结果可以看出负载肿瘤裂解物的DCs分泌IL-12的能力增高了，并且其与CTL分泌IFN-γ的增加呈正相关。这主要是由于IL-12可以影响T细胞的极化方向，由于T细胞上调IFN-γ表达，通过分泌IFN-γ等提高杀伤活性。这些结果表明用IL-12、IFN-γ的分泌来反应肿瘤抗原致敏DC对CTLs的体外诱导可能是一个有用的方法。本研究中，抗原负载DCs诱导的CTLs对乳腺癌细胞在体外有很好的杀伤活性，与未

7、致敏DC组CTLs及未成熟DC诱导的CTLs组（PBMC组）有明显差异，说明成熟DC能够呈递肿瘤细胞抗原，激发CTLs的细胞毒作用。而非乳腺癌细胞细胞（HT-29）的杀伤活性较差（P＜0.01），说明这种用负载乳腺癌细胞抗原的DC诱导的CTLs细胞毒作用有其特异性。这种良好的特异性杀伤活性表明肿瘤裂解物致敏的DC疫苗刺激的CTLs的免疫治疗可作为乳腺癌患者新治疗手段，但过渡到临床应用仍需体内实验加以证实。【