抗原冲击致敏树突状细胞诱导特异性ctl杀伤jurkat细胞实验研究

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1、抗原冲击致敏树突状细胞诱导特异性CTL杀伤Jurkat细胞实验研究作者：林东军，方志刚，李旭东，刘加军，陆英【摘要】　　本研究以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC），分别负载Jurkat细胞冻融抗原及-CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等细胞因子，密度梯度离心法、贴壁法从外周血获取单核细胞并进行诱导扩增，培养出DC，分别用冻融抗原及-CSF)，interleukin-4(IL-4)，alphatumornecrosisfactor(TNF-α)andsCD40L，DCsostsuspendedcells

2、exhibiteddistinctivemorphologicalfeaturesofDCulateproliferationofallogenEiclymphocytes.Undertheeffector∶targetratioof20∶1，CTLsderivedfromculturesculturesculturesonocytescultureorantigen-pulsedDCcaninduceefficientandspecificanti-tumorimmunity，mayplayagreatroleinclinicaltherapyf

3、orleukemia.　　Keyia　　树突状细胞(dendriticcell，DC)是已知体内功能最强的专职抗原呈递细胞，最大特点是能刺激初始型T细胞活化和增殖，是特异性免疫应答的始动者，DC在抗肿瘤免疫反应中起关键作用。但大多数白血病患者有DC功能缺陷，在体外扩增DC并诱导白血病特异性细胞毒性T细胞发挥最大限度特异性抗白血病效应，使消除白血病病灶、延长患者寿命、防止复发成为可能。本实验应用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等由健康人外周血单核细胞(monocytes)诱导活化出DC，使其分别负载Jurkat

4、细胞冻融抗原及-CSF、rhIL-4、rhTNF-α、rhsCD40L均购自美国Cytolab公司；鼠抗人FITC-CD14、CD1a、CD40、CD80、CD83、PE-CD86等流式细胞荧光标记抗体（美国eBioscience公司产品）；LDH-Cytotoxicity分析(美国Biovision公司产品)；NikonTE2000-U倒置显微镜(日本Nikon产品）；Model680型酶标仪（美国Bio-Rad公司产品）;FACSCalibur流式细胞仪（美国BectonDickinson公司产品）。急性T淋巴细胞白血病细胞株（Jurkat）为

5、I1640培养液调整细胞浓度为3×109/L，接种于25ml塑料培养瓶，在5%CO2饱和湿度、37℃条件下孵育3小时，吸出非黏附细胞，用预热的培养液洗去未贴壁的细胞，即获得贴壁的单核细胞（monocytes）。加入含10%FBS的RPMI1640培养液（含rhGM-CSF100μg/L，rhIL-450μg/L，2mmol/LL-谷氨酰胺），在5%CO2、37℃条件下培养，第3、5天半量换液，同等量添加上述细胞因子，在第5天收集悬浮细胞于6孔板培养，并添加rhTNF-α20μg/L，rhsCD40L2mg/L。第7天收获细胞，瑞氏染色并摄片，流式细

6、胞仪检测免疫表型。　　混合淋巴细胞反应(MLR)　　收集上述方法中获得的非贴壁单个核细胞（淋巴细胞），加入RPMI1640(含rhIL-220000U/L低浓度培养)，每2-3天半量换液，培养7天作为反应细胞;刺激细胞为向DC诱导的细胞，收集培养第7天的DC悬液，离心。同种异基因混合淋巴细胞反应组为实验组，与同种同基因淋巴细胞反应组为对照组。MTT法检测淋巴细胞增殖活性：DC与淋巴细胞比例分别为1∶10，1∶20，1∶100（淋巴细胞浓度为2×109/L），各0.1ml接种于96孔板，混和孵育72小时，加MTT10μl(5μg/L)再作用4小时，酶

7、标仪检测波长490nm的A值。　　Jurkat细胞冻融抗原制备和FPNAPYL，由上海生工公司合成，HPLC纯度检测>95%，分子量1108.3，取5mg溶于5mlPBS中，分装，-20℃冰箱保存备用。在DC培养的第4天每毫升培养体系实验组分别加Jurkat细胞冻融抗原及I1640培养液洗涤，重新添加细胞因子继续培养。　　IL-12含量的检测及活化T细胞免疫表型检测　　收集诱导培养的第7天DC上清，用ELISA法定量检测IL-12的含量，具体操作按试剂盒(法国Diclone公司产品)说明书进行。收集上述方法中分离获得的非贴壁异体单个核细胞，用

8、含IL-220000U/L的RPMI1640培养液培养7天，加DC继续诱导培养72小时，DC与淋巴细胞浓度比为1∶20。D