树突状细胞诱导的ctls与cik及lak细胞对神经胶质瘤杀伤作用比较论文

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1、树突状细胞诱导的CTLs与CIK及LAK细胞对神经胶质瘤杀伤作用比较论文宫安静孟庆海朱湘华【摘要】目的比较树突状细胞（DCs）诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）和淋巴细胞因子激活的杀伤细胞（LAK细胞）对神经胶质瘤的体外杀伤作用。方法向外周血单个核细胞分别加入不同细胞因子组合，诱导出DCs、CIK细胞和LAK细胞，DCs负载胶质瘤抗原后激活CTLs，MTT法检测对胶质瘤细胞的体外杀伤效应。结果CTLs对胶质瘤细胞的杀伤作用明显强于CIK细胞和LAK细胞（F=6.42～8.26，q=8.02～10.1

2、8,P＜0.01）；CIK细胞对胶质瘤的杀伤作用明显强于LAK细胞（q=8.43～9.24,P＜0.01）。CIK细胞对K562细胞的杀伤作用明显强于LAK细胞和CTLs（F=5.36～7.69，q=7.23～9.56,P＜0.01），LAK细胞对K562细胞的杀伤作用明显强于CTLs（q=8.83～9.15,P＜0.01）。结论从人外周血中诱导出的DCs负载胶质瘤抗原后，激活的CTLs在体外对胶质瘤细胞能产生高效而特异的杀伤作用.freelorefficacyamongLAK,CIKandCTLsactivatedbydendritic

3、cellsinvitro.MethodsPeripheralbloodmonocytesalysates,DCsphocytesintocytotoxicTlymphocytesforgliomacells.Thecytotoxicityacells（F=6.42-8.26，q=8.02-10.18,P＜0.01).CIKacells,respectively（q=8.43-9.24,P＜0.01)(F=5.36-7.69，q=7.23-9.56,P＜0.01).LAKkilledmoreK562cellsthanCTLsdid（q=8.

4、83-9.15,.freelacellseffectivelyandspecifically,ightplayagreatroleinclinicaltherapy.［KEYCSF、rhIL4及rhTNFα等试剂均购自STRATHMANNBIOTECHGMBH，PE标记鼠抗人CD1a、CD80、CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD56、CD83、CD86、HLADR单抗及鼠IgG1PE购自IMMUNOTECH,COULTER公司，RPMI1640购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品有限公司，淋巴细胞分离

5、液购自上海试剂二厂，MTT、二甲基亚砜购自SIGMA公司，IL2、IL1、CD3McAb、γIFN等试剂购自北京邦定生物制品有限公司。1.2标本来源神经胶质瘤来源于青岛大学医学院附属医院神经外科2003年1～12月经病理诊断为胶质瘤的病人，共20例，男女各10例；年龄10～65岁，平均47岁；其中Ⅰ级4例，Ⅰ～Ⅱ级2例，Ⅱ级4例，Ⅲ级5例，Ⅳ级5例。K562白血病细胞由中科院惠赠。1.3细胞制备1.3.1LAK细胞的制备取病人外周静脉血，用肝素抗凝，淋巴细胞分离液水平离心机梯度离心（2000r/min,20min），吸取界面白膜层细

6、胞，即为外周血单个核细胞（PBMC），接种于24孔板，加入含体积分数0.10的FCS、106U/LIL2的RPMI1640培养液培养，每隔3d换液，第6天收获细胞。1.3.2CIK细胞的制备外周血PBMC接种于24孔板，加入γIFN106U/L，24h后加入5×105U/LIL1及IL2，100μg/LCD3McAb，隔天换液，补充IL2，剂量同前。第14天收获细胞。1.3.3DCs的诱导及CTLs的制备分离外周血PBMC，加入24孔培养板，每孔1mL,在37℃体积分数为0.05CO2的饱和湿度培养箱内贴壁2h，除去非贴壁细胞，

7、用含rhGMCSF(106U/L)、rhIL4(106U/L)和体积分数为0.10FCS的RPMI1640培养液培养贴壁细胞，每3d半量换液并补充新鲜细胞因子，第7天加入50μg/LrhTNFα，第10天收获DCs。将原代培养的胶质瘤细胞用培养液悬浮成浓度为5×109/L的细胞悬液，在-80℃冷冻2min，37℃水中溶解4min，反复4～5次，裂解物离心（8000r/min,20min）收集上清，0.2μm滤器过滤，肿瘤抗原与DCs以3∶1比例混合培养18h，收集DCs,即为胶质瘤细胞抗原致敏的DCs。负载胶质瘤细胞抗原的DCs与淋

8、巴细胞按1∶10混合培养3d,即得针对神经胶质瘤细胞特异性CTLs。1.4免疫表型测定收集培养细胞，用PBS洗涤1次，悬浮为2×109/L，每管100μL加入离心管，加入单抗，4℃避光标记30